实用SCI绘图教程 | 如何用Photoshop计算WB/电泳的灰度值

我来到你的城市 2021-07-09 15:10:39 阅读: 10962

在western blot或者DNA电泳条带中，经常需要半定量统计条带的灰度值，比较常用的是用ImageJ这个软件来统计，但是如果不熟悉操作很容易得出错误的统计数据。本文从原理到操作告诉你如何用photoshop来统计灰度值

首先进行实际操作之前我们先来理解下什么叫做灰度值

如上图所示，灰度值就是从黑到白渐变过程中对应的数值。0代表黑色，255代表白色。

上图所示正常western blot条带和反向之后的条带。上图的箭头分别指出了条带以及背景对应的区域。在正常条带中条带的值约为20，背景值为80；在反向图片中，条带的值约为200，背景值为130。我们习惯了条带越粗亮灰度值越大，因此我们一般是对其进行反向之后测量。

在这里一定要去掉背景，至于为什么要去掉背景，在此不多说了（视频教程里将详细介绍）请看下面图片：

那么接下来开始我们今天的教程：

打开图片，因为图片有点倾斜，我们需要将其摆正，有两种方法进行拉直，第一种是将图层旋转(Ctrl+T，然后旋转至其摆正)，另外一种是使用标尺工具，在左边快捷栏中安卓吸管工具不放，选择标识工具，然后在条带上面从左边点按住鼠标不放一直拖动到最右边，最后点击拉直图层即可。
点击菜单栏的“窗口”，选择直方图，弹出下面面板

然后点击下图中右上角红色箭头所示，点击“显示统计数据”，得到如下：

在上面的面板中，需要注意两个数值“平均值”和“像素”，平均值即平均灰度值，像素即面积。
前面所说了，我们习惯越黑数值越大，那么我们需要对western blot图进行反相（快捷键Ctrl+I）：
我们选择快捷面板中的“矩形框选工具”，选中第一个条带：

框的位置不要太大，但也不要太小，此时，在直方图中出现了数值，我们把数值记录下来，只要记录平均值和像素即可。
我们对第二个条带进行测量

同样记录平均值和像素，这里需要注意的是，每次框选并不一定需要同样大小的区域。
全部测量之后，我们得到了如下的数据：、
注意上面有一个背景，这个背景是按照下面的方式测得的：

在背景上框选一个比较大的能够代表背景的区域，记录背景的“平均值”，
最后在于计算，我们将每个条带的 “平均值” 减去背景的 “平均值”，得到了实际的平均值，再乘以总面积就得到了该条带的总灰度值，我们将第一个条带设置值为1，得到其他条带相对条带1的值，并作图：

通过上面的柱形图和实际western blot条带目测比较，基本符合实际情况。
假设我们没有去背景会是什么样的情况呢：

可以看到，上面的相对值明显不符合实际情况。