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SnapGene # 构建融合表达载体
向表达载体中插入目的基因进行表达是个技术活~里面充满了各种需要注意的地方，
【案例】
使用双酶切的方式将一段基因序列插入pDsRed2-N1质粒中，使其能够与DsRED蛋白进行融合表达。
主要涉及到以下几个方面知识点：
1. 序列导入
pDsRed2-N1质粒可以直接在SnapGene的序列库中找到，导入方式在前面的文章中已经介绍，这里不再赘述。从图谱中选择多克隆位点区域MCS，点击，并转到序列页面：
同时，新建DNA序列，将目的基因的序列粘贴进去，用于后续的酶切位点分析。
2. 酶切位点分析
双酶切连接的酶需要满足一下要求：
一、酶切位点需要存在于MCS中，但同时不能存在于目的基因序列中。
二、两个酶切位点之间至少要有几个碱基间隔，不能紧邻或重叠。
三、最好选择成熟的内切酶。
按照以上原则，我们先看基因中的常见酶切位点：
然后在MCS中排除这些酶切位点：
之后在剩下的酶切位点中，选择常用的即可，因为HindIII、EcoRI两个酶切位点靠的太近，小编没有选择这两个的组合，以免造成双酶切的效率下降。因此，小编最终选择的是EcoRI+KpnI的酶切组合。
3. 调整融合表达的阅读框
因为目的基因需要融合下游的荧光蛋白进行示踪，所以调整阅读框的通顺性是非常重要的，首先将目的基因中的终止密码子去除，然后将载体上EcoRI+KpnI之间的序列替换为去除终止密码子之后的目的基因的序列：
观察目的基因向下游表达至DsRed2中的氨基酸序列（HGL），发现与DsRed2原始序列（MAS）不同，即发生了移码，完整的阅读框遭到了破坏。因此，我们需要在目的基因下游与KpnI之间添加碱基恢复其阅读框的正确。
从上图中可以看出，当添加了两个碱基之后，之前的两个不同的氨基酸序列合二为一，变为正确的序列，即目的Gene可以跟下游的DsRed2基因进行正确的融合表达了。(如果您的蛋白序列3端不是核心功能区，去掉一个碱基同样可以修复阅读框)
4. 设计引物
有了上述方案，即可继续进行引物设计，进行扩增目的Gene全长了。
设计全长引物的软件有Primer5、Primer3Plus等，但小编更偏好于手动设计引物，在目的基因5端，用鼠标选中合适的区域（保护碱基-酶切位点-互补配对部分），当选择区域适合作为引物时，会实时显示出其Tm值：
按Ctrl+R调出引物添加页面，正向引物选择Top Strand，正向引物就会显示在页面中。
使用相同的方法也可以设计反向引物（反向引物需要选择Bottom Strand）：
需要注意的是，扩增全长的引物5端通常情况下需要添加酶切位点和保护碱基，。而为了保证引物与模板的结合效率，互补配对部分又不宜少于15nt，因此整体引物会比较长，一般在25~35 nt，可以适当提升一下退火温度以提升扩增的特异性。
在图谱或者序列页面，按住Ctrl选中F Primer和R Primer，会将扩增产物的序列选中：
选中状态，Ctrl+C复制，然后在Word中Ctrl+V粘贴，就可以将引物连同产物一并整理到Word中了。
可见，使用合适的软件，可以使原本复杂繁琐的分析步骤变得简单，并且能够极大程度地提升效率。
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