SnapGene # TOPO®克隆简述及实例应用

我来到你的城市 2021-07-27 09:43:18 阅读: 3465

什么是TOPO®克隆技术？

TOPO®克隆（基于拓扑异构酶的克隆技术）不需要限制性内切酶或外源连接酶，从而提供了将新的PCR产物克隆到质粒中的极其简便快捷的方法。该技术依赖于互补的碱基对腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的基本能力来杂交并形成氢键。

TOPO®克隆有哪些优势

1. 【高效】高达95%的克隆包含所需的插入

2. 【快速】室温反应，仅5分钟

3. 【轻松】简单的三步

4. 【被证实】超过20,000的引用

5. 【灵活】可提供有（或无）感受态细胞，并具有多种反应大小和格式，以适应你选择的聚合酶

*但同时也需要注意TOPO®克隆的缺点，只有很少的质粒骨架可用于TOPO®，并且自己创建TOPO®载体是不可行的。

简单三步实现TOPO®克隆

TOPO PCR克隆只需要三个简单的步骤。简单地将PCR产物和TOPO克隆载体在提供的反应缓冲液中结合，等待5分钟，然后转化大肠杆菌菌株。使用TOPO克隆，可以省去连接酶介导克隆所需的额外时间、步骤和试剂。

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SnapGene如何模拟TOPO®克隆？

利用牛痘病毒拓扑异构酶I与3 '磷酸基共价结合的线性化载体，TOPO®克隆可以高效克隆PCR产物。SnapGene模拟了这种方法的三种不同变化，

TOPO®TA克隆（TOPO® TA cloning）使用线性化载体（Linearized Vectors，如pcDNA™3.4TOPO®）克隆3'-A突出端的PCR产物。这些PCR产物通常由Taq聚合酶产生；
Blunt TOPO®克隆（Blunt TOPO® cloning）使用线性化载体（例如pCR®-BluntII-TOPO®）来克隆具有平头突出端（Blunt Overhangs）的PCR产物。这些PCR产物通常由高保真聚合酶产生；
定向TOPO®克隆（Directional TOPO® cloning）使用线性化载体（例如pET200 /D-TOPO®）以定向方式克隆PCR产物

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SnapGene通过自动化引物设计简化了TOPO®克隆。要设计TOPO®克隆过程，选择你想要扩增的DNA片段，然后从SnapGene软件中嵌入的列表中选择TOPO®克隆载体。然后，SnapGene将选择合适的引物

SnapGene可以模拟三种不同类型的TOPO®克隆。那么具体在SnapGene上如何操作呢？首先从定向TOPO®克隆开始，一起跟小编实际操作一下吧！

丰富资源库，自动引物设计

SnapGene提供所有商用TOPO®载体序列库，随时可以在SnapGene中使用。如果需要，SnapGene将自动设计适当的插入特异性引物，用于定向TOPO®克隆。

1. 打开“TOPO定向克隆对话框”

操作：点击Actions→TOPO®克隆→Directional TOPO®克隆… 打开“定向TOPO®克隆”窗口。

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2. 选择插入(Insert)

操作：“插入(Insert)”选项卡 - “插入源(Source of Insert)”菜单 - “插入(Insert)”文件或 “浏览(Browse)”

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*选择所选序列中将被扩增以进行定向TOPO®克隆的区域。单击“地图”或“序列”视图中的特征以将其选中，或切换到“序列(Sequence) ”视图以选择精确区域。单击“插入方向(Orientation of insert)”按钮以设置所需的插入方向。

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Tips

如果你在打开并查看序列文件之前，单击Actions→TOPO®克隆→Directional TOPO®克隆…，开放序列会自动设置为“插入源(Source of Insert)”。

3. 选择Vector

操作：切换到“线性化矢量(Linearized Vector)”选项卡，然后从“商业线性化(Commercial Linearized)”定向TOPO®矢量列表中选择要使用的矢量。

4. 设计引物

操作：切换到“产物(Product)”选项卡，然后单击“选择PCR引物...”以设计新的插入特定PCR引物。

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*确认将扩增正确的区域，设置所需的引物Tm，然后单击“选择引物”。

Tips

SnapGene将设计适当的正向和反向引物来扩增插入物。正向引物将包含确保定向TOPO®克隆所需的"5'-CACC"基序；
如果插入片段已经具有定向TOPO克隆所需的5' "CACC"基序，可以不要设计PCR引物。在这种情况下，在“插入”视图中，设置“插入源”，然后选择“直接用作模板(Use directly as the template)”。请注意，仅当序列中存在5' "CACC"主题时，“直接用作模板”选项才可用。

5. 确认预测的插入序列和连接产物

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操作：新设计的引物用来扩增插入序列。正向引物将包含一个5' "CACC"基序，赋予TOPO®-mediated的插入物与载体连接的方向性。在“产物(Product)”选项卡中，切换到“序列”视图，并确认模拟的连接方向正确，并且在基于矢量的阅读框内。如果需要将核苷酸(nucleotides)插入正向或反向引物中以确保符合读框融合，请切换回“插入”面板并手动编辑引物序列。

最后不要忘记输入新序列的名称。

6. 给新的引物命名

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