DNA加合物损伤可以由多种外源因子诱导产生，包括阳光中的紫外线、顺铂等化疗药物、香烟和汽车尾气中的苯并芘以及来自霉变食物的黄曲霉素B1等。它们会干扰DNA复制和转录，诱导突变和细胞死亡，最终导致癌症及其它疾病。在包括人类在内的高等哺乳动物中，核苷酸切除修复是唯一能修复DNA加合物损伤的途径。根据损伤识别方式的不同，核苷酸切除修复分为全基因组修复和转录偶联修复两条亚途径，前者的分子机制已经获得了充分研究，后者是由被损伤阻挡的RNA聚合酶II（PolII）来识别损伤，但因为无法在体外重建反应，其机制还有很多不清楚的地方。另外，DNA加合物损伤会引起局部组蛋白修饰变化，而染色质环境也会影响核苷酸切除修复，但其细节和机制都有待进一步研究。检测相关蛋白和DNA损伤的相互作用对于上述DNA修复和损伤应答过程的机制研究至关重要，然而，由于DNA加合物损伤在基因组上的分布具有随机性，在基因组水平上检测蛋白与DNA加合物损伤的相互作用具有很大的挑战性。
2023年1月30日，复旦大学生物医学研究院胡晋川课题组和钱茂祥课题组在Nucleic Acids Research杂志在线发表了题为Genome-wide mapping of protein-DNA damage interaction by PADD-seq的研究论文，开发了一种能以单碱基分辨率检测蛋白与DNA加合物损伤相互作用在基因组上分布的测序方法——Protein-Associated DNA Damage Sequencing(PADD-seq)。
染色质免疫共沉淀结合高通量测序（ChIP-seq）是检测基因组水平蛋白-DNA相互作用最常用的技术。由于DSB可以通过限制性内切酶（I-SceI、AsiSI和CRISPR/Cas9等）在基因组上特定位置诱导产生，ChIP-seq也被用于检测蛋白与DNA双链断裂损伤（DSB）的相互作用，但DNA加合物损伤目前无法实现定点诱导，因此无法直接检测基因组水平上蛋白与加合物损伤的相互作用。为了解决这个问题，作者通过ChIP捕捉与特定蛋白结合的DNA片段，再利用以前建立的Damage-seq技术检测损伤在这些片段上的准确分布，从而获得与蛋白结合的DNA损伤在基因组上的分布。在Damage-seq中，双链DNA片段首先被加上接头，然后依靠识别DNA损伤的抗体IP捕捉含损伤的单链DNA片段，再利用高保真DNA聚合酶被损伤阻挡的特点检测损伤的准确位置（1，2）。Damage-seq适用于100ng-1μg基因组DNA，由于ChIP获得的DNA总量有限，作者对Damage-seq进行了优化，使其可以用于25-100ng DNA，而特异性不受影响。通过联合ChIP和Damage-seq技术，作者成功建立了PADD-seq方法，并在UV照射过的人类细胞中验证了PolII会被UV损伤（CPD）所阻挡。
利用PADD-seq，作者解析了转录偶联修复过程中PolII与UV损伤的相互作用的动态变化，发现具有转录偶联修复的细胞中PolII与损伤的结合会在UV照射后2小时内消失，而在修复缺陷的CSB敲除细胞中PolII会长期滞留在损伤位点。此外，作者还分析了组蛋白H3K9乙酰化（H3K9ac）与顺铂损伤之间的相互作用，成功检测到发生在顺铂损伤附近的H3K9ac变化。ChIP是非常成熟的技术，可以用于很多蛋白；Damage-seq除了可以用于检测UV和顺铂损伤等DNA加合物损伤（1，2），胡晋川/钱茂祥课题组在之前的研究中还利用类似的策略检测了8-氧-鸟嘌呤和尿嘧啶等碱基修饰在基因组上的准确分布（3，4）。因此，PADD-seq可以用于检测多种蛋白和不同DNA损伤之间的相互作用，未来将在DNA修复和损伤应答的机制研究中发挥重要作用。
复旦大学生物医学研究院青年研究员胡晋川和钱茂祥是论文的共同通讯作者，复旦大学生物医学研究院博士研究生祝永昌、谈远清和硕士研究生李琳为论文的共同第一作者，复旦大学生物医学研究院蓝斐研究员为本研究提供了重要帮助。本研究获得了国家重点研发计划和国家自然科学基金面上计划等项目的资助。
原文链接：
https://doi.org/10.1093/nar/gkad008
1.Hu, J., Lieb, J.D., Sancar, A. & Adar, S. Cisplatin DNA damage and repair maps of the human genome at single-nucleotide resolution. Proc Natl Acad Sci U S A113, 11507-11512 (2016).
2.Hu, J., Adebali, O., Adar, S. & Sancar, A. Dynamic maps of UV damage formation and repair for the human genome. Proc Natl Acad Sci U S A114, 6758-6763 (2017).
3.An, J. et al. Genome-wide analysis of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine at single-nucleotide resolution unveils reduced occurrence of oxidative damage at G-quadruplex sites. Nucleic Acids Res49, 12252-12267 (2021).
4.Jiang, L.D. et al. UdgX-Mediated Uracil Sequencing at Single-Nucleotide Resolution. Journal of the American Chemical Society144, 1323-1331 (2022).
