造血干细胞（Hematopoietic stem cell，HSC）具有自我更新和分化为所有下游血细胞的能力，在整个生命周期中不断为机体提供新鲜血液1。在衰老过程中，HSC会发生髓系分化偏好、淋系分化减少、造血重建能力受损和克隆性造血等一系列变化，最终可能诱发免疫力低下、贫血或白血病等血液疾病2，目前仍然缺乏有效逆转HSC衰老的方法。HSC的稳态维持和衰老与其所定位的骨髓微环境密切相关，其中LepR+骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cell，BMSC）不仅可以分泌Scf和Cxcl12等因子维持HSC自我更新3,4，而且富集骨骼干细胞从而调控成体骨骼稳态和损伤修复5,6。骨髓微环境在衰老过程中会发生骨质疏松、脂肪积累、血管退变、神经与血管周细胞减少等现象7，然而人们对于衰老骨髓的生物物理特性改变却知之甚少。此外，能否通过改变骨髓微环境逆转HSC衰老仍然存在争议。
2023年4月6日，同济大学生命科学与技术学院、附属东方医院再生医学研究所岳锐课题组在国际著名学术期刊Cell Stem Cell在线发表了题为“Harnessing matrix stiffness to engineer a bone marrow niche for hematopoietic stem cell rejuvenation”的研究论文（图1），并获同期评述（Preview）。该研究发现基质硬度密切调控骨髓造血微环境，并利用柔软的甲基丙烯酰化水凝胶（GelMA）构建了BMSC与HSC的体外3D共培养体系。该系统不仅可以促进HSC自我更新和淋系分化，而且能够显著逆转衰老HSC的各项功能指标。此外，研究人员还揭示了骨髓硬化是血液系统衰老的新型标志物。这一重要研究成果为衰老HSC年轻化以及衰老相关疾病治疗提供了新思路和新策略。
图1. 文章截图
研究人员首先利用流变仪测量了年轻小鼠骨髓块的硬度，发现其相当柔软（约为200Pa）。随后，他们利用荧光报告小鼠（ScfGFP; Cxcl12DsRed）发现BMSC在体外进行2D培养时Scf和Cxcl12表达显著下调，而将其转移到柔软的5% GelMA水凝胶（硬度与年轻小鼠骨髓相仿）中进行3D培养时，细胞形态与Scf和Cxcl12表达得到明显恢复。研究者对原代（未经培养）、2D和3D培养的BMSC进行了RNA-seq和ATAC-seq分析，发现3D培养后的BMSC状态介乎于原代和2D培养之间。与原代和3D培养的BMSC相比，2D培养的BMSC细胞周期明显加快，Hippo以及RhoA信号通路相关基因显著上调。ATAC-seq分析表明Yap/Taz下游的转录因子Tead2/Tead4 结合位点在2D培养的BMSC中显著开放。与之相符，2D培养的BMSC中Yap/Taz主要定位于核内，而原代及3D培养的BMSCs中Yap/Taz主要定位于核外或呈均匀分布。F-actin染色及G-LISA实验结果显示位于Yap/Taz上游的RhoA/ROCK信号通路在2D培养的BMSCs中激活，而在3D培养后被显著抑制。最后，研究人员通过敲除Yap/Taz或者过表达组成型激活的Yap（YAP-5SA），证明Yap/Taz能通过感知基质硬度改变从而调节BMSC增殖状态和HSC维持因子表达（图2）。
图2. Yap/Taz感受硬度变化并调控BMSC增殖与HSC维持因子表达
接下来，研究者通过对培养基成分和GelMA硬度的筛选优化，构建了BMSC与HSC体外3D共培养系统。他们发现与BMSC在柔软的5% GelMA中进行3D共培养能够促使HSC产生更多的造血干祖细胞。竞争性移植实验也证明柔软的5% GelMA比更硬的10% GelMA培养条件，以及相同数量未经培养的原代HSC具有更强的多谱系重建能力，尤其是淋系重建能力。由于衰老HSC的淋系分化能力明显减弱，因此研究者随即尝试利用该系统逆转HSC衰老。他们首先对原代年轻（2月龄）和中年（12月龄）HSC，以及3D共培养后的年轻和中年HSC进行了RNA-seq分析，发现淋系分化相关基因在3D共培养后（年轻和中年）的HSC中显著富集。与之相反，衰老相关基因则在3D共培养后的中年HSC中发生扭转。研究者通过对HSC线粒体膜电位和Cdc42/Tubulin极性分布分析发现，3D共培养可显著逆转HSC衰老标志物。此外，他们还通过竞争性移植实验证明3D共培养后的年轻和中年HSC的造血重建能力显著高于原代HSC，尤其是其淋系分化能力。更为重要的是，二次移植实验发现3D共培养后的年轻和中年HSC表现出与原代年轻HSC完全相同的多谱系长时程造血重建能力（图3）。研究者还分析了年老（24月龄）HSC的年轻化效果，并利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和移植实验对3D共培养后的淋系祖细胞（CLP）和HSC进行了深入分析，从而证明3D共培养可以促进CLP分化并有效逆转HSC衰老（图4）。
图3. 与BMSC进行体外3D共培养促进衰老HSC年轻化
图4. scRNA-seq分析与纯化后HSC移植
以上结果提示骨髓基质硬度可能密切调控HSC衰老。为了验证这一假设，研究者利用原子力显微镜对年轻、中年及年老小鼠长骨骨髓进行了原位测量，发现小鼠骨髓基质硬度随年龄的增长显著增加。他们通过对不同年龄段BMSC的scRNA-seq数据进行分析发现，Scf和Cxcl12表达伴随骨髓硬化显著下调，RhoA信号通路被显著激活。研究者还发现与年轻BMSC相比，年老BMSC中Yap/Taz核外分布的细胞比例减少，核内分布的细胞比例明显增加。以上数据表明衰老小鼠骨髓硬度增加，BMSC中Yap/Taz信号通路被激活，这可能与HSC维持因子下降和HSC衰老密切相关（图5）。
图5. 衰老伴随骨髓硬化和造血维持能力下降
综上所述，该研究揭示了基质硬度在调控骨髓造血微环境中的关键作用，并应用该原理在体外成功构建了柔软的年轻骨髓微环境用于HSC的维持和年轻化。此外，该研究还发现骨髓硬化是造血系统衰老的重要标志物（图6）。这一研究成果表明通过改变骨髓微环境逆转HSC衰老是一种行之有效的方法，从而为改善HSC质量、逆转机体系统性衰老和治疗重大血液疾病提供了创新策略。
图6. Working Model
本项研究工作由同济大学岳锐教授指导完成，主要合作者包括华东理工大学王靖教授、中国科学院应用物理研究所王丽华研究员、同济大学高绍荣教授、高亚威教授和王启刚教授。同济大学研究生张潇颖、曹丹丹、徐丽婷和许艳华为本文共同第一作者。该项研究获得了科技部国家重点研发计划，基金委面上和重大培育项目的大力支持。岳锐教授实验室常年招收研究生、博士后与科研助理，欢迎访问实验室网页了解详细信息：
https://life.tongji.edu.cn/03/11/c12618a131857/page.htm。
参考文献：
1.Yamamoto, R. et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell 154, 1112-1126, doi:10.1016/j.cell.2013.08.007 (2013).
2.Akunuru, S. & Geiger, H. Aging, Clonality, and Rejuvenation of Hematopoietic Stem Cells. Trends Mol Med 22, 701-712, doi:10.1016/j.molmed.2016.06.003 (2016).
3.Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G. & Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature 481, 457-462, doi:10.1038/nature10783 (2012).
4.Ding, L. & Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells and early lymphoid progenitors occupy distinct bone marrow niches. Nature 495, 231-235, doi:10.1038/nature11885 (2013).
5.Yue, R., Zhou, B. O., Shimada, I. S., Zhao, Z. & Morrison, S. J. Leptin Receptor Promotes Adipogenesis and Reduces Osteogenesis by Regulating Mesenchymal Stromal Cells in Adult Bone Marrow. Cell Stem Cell 18, 782-796, doi:10.1016/j.stem.2016.02.015 (2016).
6.Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G. & Morrison, S. J. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell 15, 154-168, doi:10.1016/j.stem.2014.06.008 (2014).
7.Verovskaya, E. V., Dellorusso, P. V. & Passegue, E. Losing Sense of Self and Surroundings: Hematopoietic Stem Cell Aging and Leukemic Transformation. Trends Mol Med 25, 494-515, doi:10.1016/j.molmed.2019.04.006 (2019).
专家点评1：
兰雨研究员（暨南大学）
随着时代进入老龄化社会，衰老相关的生理病理状态及疾病的发生日益成为影响生命健康的重要因素。除了“延缓衰老”，对于如何“逆转衰老”的研究尤其成为现今生命科学和医学领域的重要命题。随着个体衰老，造血干细胞也会衰老，表现出造血重建能力下降、髓系分化偏好、克隆造血等特征，这不仅造成机体免疫力下降，克隆造血也带来血液系统恶变的高风险。2023年4月6日，同济大学岳锐课题组在Cell Stem Cell杂志上发表了题为“Harnessing matrix stiffness to engineer a bone marrow niche for hematopoietic stem cell rejuvenation”的研究论文，通过操控体外3D基质材料的硬度（stiffness）拟合年轻态的骨髓造血微环境，有效逆转了造血干细胞的衰老，实现了衰老造血干细胞的年轻化。该研究强调了骨髓造血微环境中非细胞成分的基质骨架对于协同调控造血干细胞功能的重要性，为血液学、运动医学、干细胞生物学、组织工程学的进一步学科交叉带来契机和方向，也为人工操控微环境实现包括造血干细胞在内的多种组织细胞类型的衰老逆转带来新的思路。
研究者首先利用骨髓造血微环境研究的重要荧光报告小鼠（ScfGFP;Cxcl12DsRed）发现骨髓基质细胞在体外进行2D培养时Scf和Cxcl12的表达显著下调，而在甲基丙烯酸明胶(GelMA)水凝胶中进行3D培养时，Scf和Cxcl12的表达以及基质细胞的形态都得到恢复，尤其是硬度更低的5%GelMA（与天然的年轻骨髓硬度类似）较7.5%和10%的GelMA效果更好。这提示在这种软的3D材料支撑下骨髓基质细胞对造血干细胞的支持作用可能较2D或者硬度高的3D水凝胶共培养体系更强。
接下来，研究者通过对培养基成分的筛选优化构建了骨髓基质细胞与造血干细胞的体外3D共培养系统，发现在柔软的5% GelMA水凝胶中进行3D共培养，相较于2D或者硬度高的10% GelMA水凝胶3D共培养体系，产生了更多的表型和功能造血干细胞。尤其是体内移植重建实验发现，经历5% GelMA的3D共培养后的造血干细胞产物，相较相同数量未经培养的原代造血干细胞，具有相当的全血重建能力和更强的淋系重建能力。这表明这种柔软的3D基质共培养系统维持了功能造血干细胞的数量并且促进了其淋系造血能力。
令人惊喜的是，研究者继而探索并证实了该系统可以逆转衰老的造血干细胞。中年小鼠（12月龄）造血干细胞在上述3D软基质共培养后的产物在一次移植4个月后的总重建和淋系重建甚至比相同数量未经培养的年轻小鼠（2月龄）原代造血干细胞更强，而且在二次移植后仍表现出与原代年轻造血干细胞相当的多谱系长期造血重建。转录组测序分析证实了3D共培养后淋系分化相关基因在造血干祖细胞中显著富集，共同淋系祖细胞数量增加，而造血干细胞衰老相关基因特征则发生逆转。
最后，研究者利用原子力显微镜对年轻、中年及年老小鼠长骨骨髓进行了原位测量，发现小鼠骨髓基质的硬度随年龄的增长而增加，而Scf和Cxcl12的表达伴随骨髓硬化显著下调。表明骨髓硬化与衰老过程中造血干细胞微环境受损有关，骨髓基质硬化可以作为造血系统衰老的重要力学标志物。这个发现也更新了大家对于“个体衰老后骨质疏松以及骨髓脂肪化增强可能对应骨髓硬度下降”的传统认知推断。
该工作除了对于人类造血干细胞衰老逆转策略研究提供了重要的思路和方向，具有潜在的转化和临床应用价值，也进一步带来一系列有趣的科学问题。例如，骨髓基质硬度的决定因素有哪些？对于这样因素的干预是否可以改善骨髓基质硬度从而改善造血干细胞的功能？有哪些与骨髓基质硬度改变相关的疾病？相应的病理状态是否影响了造血干细胞的功能稳态？此外，该研究进一步强调了造血干细胞的功能可塑性，所建立的3D软基质共培养系统是否可用于造血干细胞的发育和重头再生研究也值得尝试。
专家点评2：
张维绮研究员（中国科学院北京基因组研究所）
造血干细胞（HSC）是造血系统的源头，具有分化成红细胞及各种免疫细胞的潜能，对于维持机体的生命和免疫力发挥了重要作用。造血干细胞老化驱动整个造血系统的衰老。随着年龄增长，造血干细胞数量减少，DNA损伤增加、功能障碍和髓系偏向，引发老年人贫血、免疫力低下等衰老表现。人们既往关注骨髓衰老，多将目光聚焦于造血干细胞自身的改变，往往忽略了周围骨髓微环境对造血干细胞衰老的调控。目前，如何延缓造血干细胞衰老，以及能否通过改变骨髓微环境逆转造血干细胞衰老仍然是领域难题。
同济大学生命科学与技术学院、附属东方医院再生医学研究所岳锐教授课题组在近期的研究中揭示了通过骨髓基质硬度影响造血系统衰老的新机制，并提出了造血系统衰老的新型标志物，为实现造血衰老的干预提供了理论基础和方法学依据。
骨髓基质细胞（BMSC）中Scf和Cxcl12的表达与分泌被认为可以维持造血干细胞自我更新，本研究通过在柔软的5% GelMA水凝胶中3D培养BMSCs，逆转了在2D培养环境中双因子的下调。这表明环境硬度是基质细胞衰老的重要影响因素。骨髓硬度可能通过影响BMSC中转录因子Yap/Taz的核定位，来调节BMSC增殖状态和HSC维持因子表达。通过模拟最接近年轻骨髓硬度和微环境特征的3D培养系统，岳锐教授团队找到了5% GelMA的最优解，在该环境下共培养的BMSCs和HSCs，表现出了衰老标志物的逆转与分化潜力的重塑。以上结果除了在体外3D培养体系中被验证，同时也与不同年龄阶段的小鼠长骨骨髓变化相一致。以上结果表明，基质硬度可以通过BMSC负调控的HSC微环境因子表达，Yap/Taz信号可以感知硬度的变化以促进BMSCs的扩增。
本研究为系统理解骨髓和造血系统衰老提供了崭新的视角，为进一步探索骨髓微环境提供了研究典范。该研究也提示应进一步关注BMSC与骨髓微环境的交互信号，以及进一步优化3D培养系统，例如通过添加骨髓内皮细胞来提高骨髓基质细胞的存活率，以更好地模拟体内的造血干细胞周围环境。总而言之，本研究发现了在柔软的5% GelMA水凝胶中3D共培养可以逆转衰老HSC的髓系偏向及其它衰老特征，为造血系统的衰老研究开辟了新的方向，为通过改造衰老的骨髓硬度，从而恢复造血干细胞年轻态及干预血液相关疾病提供了理论支撑。
