大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段实验-随即寡核苷酸引物介导
此法是一种用以产生高放射比活、放射标记均匀分布的04八片段的切口平移方法。
1. 用合适的限制性内切酶消化DNA，DNA片段经电泳纯化或乙醇沉淀，用TE缓冲液重悬。
2. 在冰浴中混合下列物质：
（1）2.5 μl 0.5mmol/l 3dNTP混合液
（2）2.5 μl 10×klenow酶缓冲液
（3）5 μl 3000Ci/mmol［α-32P］标记dATP
（4）1 μl klenow片段
3. 将30~100 ng DNA与随机核苷酸六聚体（1~5 μg）混合至14 μl，煮沸2~3 min，置于冰浴。
4. 加入11 μl 得自步骤2的混合物，立即在室温温育2~4 h。
5. 加入1 μl 0.5mol/l EDTA以终止反应，加入3 μl 10 mg/ml tRNA和100 μl TE 缓冲液。
6. 酚抽提，移上清至一个新离心管中。
7. 用层析法将未掺入的放射性前体dATP从标记DNA中去除。
7. 取出1 μl 小份样品确定32P的掺入效率。（比活度应为108 cpm/μg）
