一、Cas9靶位点的选择  

Cas9靶位点（靶点）包含20个碱基，其中5’端应为GG▲；紧邻靶点3’端的3个碱基构成PAM区，要求序列为NGG（N为任意碱基）（图1）。可在正义链或反义链上选择靶位点。可参考如下的Cas9靶位点预测网站：http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx  

注意：5’端选择GG并非Cas9靶点本身的要求，而是由于本实验所用的gRNA（guide  RNA）体外转录载体采用了T7启动子。T7启动子要求转录起始位点的前两位为GG，并且第三位最好为G或A；如果采用其他的启动子，可以随之更改。

二、Cas9靶位点的确认

1. 确认靶点在基因组中的唯一性：靶位点序列在Ensembl网站进行blast，确认是斑马鱼基因组中的单一位点。2．PCR扩增靶点序列：从准备用于打靶的成鱼中PCR扩增靶点及附近的序列。在靶位点周围设计引物，使其距离靶位点两侧都大于100 bp，并且PCR扩增产物最好不要超过500 bp，且为单一条带。 3．检测酶切效率：如果计划采用酶切法检测靶点的突变情况，则需要对上述PCR产物进行酶切验证。要求尽量酶切完全，并且电泳后能明显与原条带区分开。 4．测序确认靶点序列：将PCR产物直接送去测序（不需要TA克隆）。如果实测序列跟靶点的预测序列有出入，原则上应根据实测结果设计gRNA序列；但是，如果实测序列不再符合靶点选择的原则（例如，PAM区不是NGG，或5’端不是GG），则应重新选择靶点；如果测序结果显示靶点序列为杂合子，则最好重新选择实验材料。 5．遴选实验材料：采用上述的PCR与测序策略筛选出足够量的靶点正确且为纯合的成鱼，后续针对该靶点的实验最好都用这一批成鱼进行。

三、合成gRNA

设计特定靶点gRNA引物，以pDR274 为模板，PCR扩增。以液体回收方式纯化PCR产物。

四、制备Cas9 mRNA和gRNA  1．制备Cas9 mRNA：

(1)制备Cas9 mRNA的体外转录模板：通过XbaI单酶切线性化pSP6-2sNLS-spCas9载体 （Amp抗性）（37℃，4 h以上）；取少量电泳确认线性化完全后，直接回收线性化产物。

(2)体外转录Cas9mRNA。  mRNA体外转录体系（SP6mMESSAGE mMACHINE® Kit，Ambion）：

(3)添加polyA序列、回收得到可用于显微注射的Cas9 mRNA（添加polyA序列可增强 mRNA的稳定性和翻译效率）。  mRNA加polyA的反应体系：  （这里选用的是NEB的加A体系；也可以使用Ambion的加A试剂盒）

2． 制备gRNA：  （1）制备gRNA的PCR体外转录模板：用T7-cr fwd和tracr rev引物对，以构建好的gRNA体外转录载体（例如pT7-thgRNA质粒）为模板，使用高保真酶PCR，得到gRNA体外转录模板（58℃退火，延伸30 sec，40 cycle，40 μL体系）。取1 μL PCR产物电泳，确认为单一条带（125 bp）后直接回收PCR产物，用于后续的步骤。  T7-cr fwd序列：5’-GAAATTAATACGACTCACTATA-3’ tracr rev序列：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’ （2）体外转录gRNA。  gRNA体外转录体系： （这里选用的是Ambion的MAXIscript® T7 Kit；也可以使用其它的体外转录体系，例如Promega的产品，但是不要用体外转录mRNA的体系。）（3）回收gRNA：建议使用Ambion的mirVana™ miRNA Isolation Kit进行回收。也可采用LiCl沉淀法，但效率较低。 用mirVana™ miRNA Isolation Kit回收小片段RNA。