双脱氧法DNA测序实验-测序酶进行标记测序反应

1. 对于每个单链模板：将下列试剂混合于0.5 ml 微量离心管中

（1）0.5 pmol 单链DNA模板

（2）0.5 pmol 引物

（3）1 μl 10×测序酶缓冲液

（4）加水至10 μl

（5）用吸管上下抽吸轻轻混匀（避免产生气泡）。于65℃温育6 min，然后于37 ℃温育20 min，转到步骤3。

2. 对于每个双链DNA模板：以下列混合液重溶含0.5 pmol 变性双链模板的干燥沉淀物。

（1）1 pmol 引物

（2）1 μl 10×测序酶缓冲液

（3）加水至10 μl

（4）用吸管上下抽吸轻轻混匀（避免产生气泡），于37℃温育30 min，然后在此退火温度下放置直至进行步骤3。

3. 当引物正和模板退火时，对应每个待测模板，分别标记好A、C、G、T 4个微量离心管。

DNA测序用酶的特性

3. 分别加入2.5 μl A、C、G、T 测序酶终止混合液至A、C、G、T管的底部

4. 在临用前，才用测序酶稀释液稀释测序酶/焦磷酸酶混合物至1~ 2 U 测序酶/μl，置于冰浴。

5. 将下列试剂加入已退火的引物和模板中

（1）2 μl 标记混合物

（2）0.5~1.5 μl 10 mCi/ml［α-³²P］dATP

（3）2 μl 稀释的测序酶/焦磷酸酶混合液

（4）总体积在14.5~16 μl，于25℃（室温）温育5 min。

6. 加入3.5 μl 标记反应物至含测序酶终止混合物A的微量离心管中。

7. 用吸管上下抽吸轻轻混匀，对 A、C、G、T 管重复此过程，每次均需更换吸头，于37℃温育5~10 min。

8. 加入4 μl 终止/加样染料液，于95℃水浴2 min，然后置于冰浴。

9. 每样品各取2~3 μl 加样于测序胶进行凝胶电泳并读出序列。