离体线粒体的氧化作用和磷酸化作用实验
当供给植物组织充足的氧气时，植物细胞可使底物完全氧化。以葡萄糖为呼吸底物完全氧化时，最后生成CO2，吸收的O2被还原成水，并且每克分子葡萄糖的氧化产生38克分子ATP： 其中大部分ATP是通过称为氧化磷酸化作用形成的，这也是细胞内形成可利用能量的主要过程，现在可以肯定三羧酸循环及其与之相偶联的氧化磷酸化作用是在线粒体中进行的。在线粒体中进行这些反应的速度可用耗氧量来表示，也可用形成ATP的量来表示。 本实验用黑暗中萌发的绿豆子叶或黑暗催芽的马铃薯块茎制备离体的线粒体，以琥珀酸为底物定性测定O2的消耗和产生的ATP，并应用丙二酸抑制呼吸作用观察耗氧量的变化。
一、仪器药品
1．提取液：0.1 M 磷酸缓冲液pH7.0 含0.4M 蔗糖，
0.005M EDTA 
2．反应液：
（1）0.1M磷酸缓冲液pH7.0
（2）1.5M蔗糖溶液（25.67g蔗糖用蒸馏水定容为50 ml ）。
（3）ADP（腺二磷）50mg/ ml （50mgADP溶于1 ml 水中）。
（4）CytC（细胞色素C）1mg/ ml （1mgCytC溶于1 ml 水中）。
（5）NAD（氧化辅酶Ⅰ）3.3mg/ ml （3.3mgNAD溶于0.5 ml 水，用NaOH调至pH7.0，再定容为1 ml ）。
（6）CoA（辅酶A）（每支50单位，250单位相当于1mg）。
（7）TPP（焦磷酸硫胺素）50mg/ ml （3.3mgNAD溶于0.5 ml 水，用NaOH调至pH7.0，再定容为1 ml ）。
（8）0.2MMgCl2(2.03gMgCl2·6H2O定容于为50 ml )。
（9）1.1M葡萄糖（10.9葡萄糖加水定容为50 ml ）。
（10）0.1M琥珀酸（0.118g琥珀酸溶于5 ml 水，用NaOH调至pH7.0，再定容为10 ml ）。
3．0.1M丙二酸（pH7.0）
0.017g丙二酸溶于1 ml 水中，用NaOH调至pH7.0，再定容为2 ml 。
4．0.025 N HCl 二、实验步骤
1．线粒体悬浮液的制备
（1）25℃下暗处萌发3－4天的绿豆芽，摘取子叶，去掉下胚轴、根和芽。
（2）取30g子叶、40 ml 提取液和少量石英砂，在研钵中（研钵置于冰盐浴中）快速研磨成匀浆，双层纱布过滤。
（3）滤液于0℃下，3000rpm离心10分钟，弃去沉淀。
（4）上清液于0℃下，12000rpm离心20分钟，弃去上清液。沉淀悬浮于18 ml 提取液中。
（5）上述悬浮液在0℃，12000rpm下离心20分钟，弃去上清液，沉淀悬浮于2 ml 提取液中，即为线粒体悬浮液。保存在冰箱中。
2．仪器安装及耗O2量的测定
反应瓶主室中按下表加入反应液：
如图，安装好测氧仪、氧电极、记录仪。检查仪器是否正常。在侧臂中加入0.5 ml 线粒体悬浮液，插入氧电极，密闭反应瓶，待测氧仪稳定后，将侧臂内线粒体悬浮液轻轻倒入反应室，在磁力搅拌器上搅拌或不断地轻轻摇动反应瓶。20℃下反应10分钟。记录氧分压的变化，由记录曲线比较正常的线粒体和加抑制剂的线粒体耗O2的变化。
测氧装置图
3．测定ATP的形成
（1）DEAE──纤维素的再生：使用以后的纤维素先用0.5N NaOH溶液浸泡30分钟－1小时，然后用布氏漏斗滤去NaOH溶液，再用0.5NHCl溶液浸泡30分钟－1小时，用蒸馏水冲洗至中性，备用。
已处理好备用的DEAE──纤维素（DE－22），倾倒去过多的水，将纤维素搅拌后均匀地铺在干净的玻璃板上，然后轻轻振动玻璃板，使纤维素分布均匀、表面光滑。放于60℃处烘干备用。
（2）点样：用血色素吸管吸取①标准APP10mm3，②反应液20mm3，③线粒体悬液20mm3，④反应10分钟后的样品20mm3分别在DEAE──纤维素薄层上点样，用冷风吹干。
（3）展层：层析缸中倒入0.025N HCl，将纤维素薄层平放入内，使液面低于点样线，盖好盖子，待前沿走到离薄层上端1 cm 时立即取出，用热风吹干。 （4）风干后的薄层板在紫外分析灯下观察形成的ATP。
实验记录及报告
