纸谱分析亦称滤纸层析，是将混合的溶液在滤纸上用层析溶剂加以分离的鉴定或定量的技术。层析溶剂由有机溶剂和水组成，其中水分子被滤纸的纤维素所吸附，成为固定相，而有机溶剂则成为推动相。当推动相沿滤纸移动时，样品中各种溶质因在二相中的分配系数（即在二相中溶解度的比例）不同而造成亲脂性较强的溶质移动较快，而亲水性较强的溶质移动较慢，结果使混合物分离。最后用显色剂对分离物进行显色鉴定。不同物质移动速率不同，故有不同的Rf值（比移率），可用作定性时参考。   纸谱分析有单向、双向之分。凡成分较简单而易于分离的可用单向层析，否则可用双向层析，

一、材料仪器设备及试剂

1 .材料：植物根系伤流液。

2.  仪 器设备：层析缸；层析滤纸；微量滴管或玻璃毛细管；电吹风或电炉；烘箱；小喷务器。

3.  试 剂：正丁醇；冰醋酸；95%乙醇。

标准氨基酸溶液：天门冬氨酸，赖氨酸，丙氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸，精氨酸，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，脯氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸等氨基酸分为3～4组溶于10﹪异丙醇中，即为标准氨基酸溶液混合液，每种氨基酸浓度为2mg. ml-1。

0.1%水合茚三酮乙醇溶液：称取0.1g水合茚三酮，溶于100 ml 95%乙醇中。

苯酚和水混合溶剂: 苯酚 ：水（比例为3 :1）。

二、实验步骤

1. 单向层析

（1）点样：取层析滤纸一条，长约25cm，宽约4～5cm（如样品数多则应加宽）。在滤纸一端离边1.5～2cm处用铅笔轻轻划一线，然后用微量滴管或毛细管吸取伤流液在铅笔线的适当位置上点一点，另用标准氨基酸混合液在附近加一点（约5μl）。点的大小以不超过0.3cm为宜，二个样品之间应相距1.5～2cm。然后用电吹风吹干或在电炉上一定距离处烘干滤纸，注意温度不能超过80℃。如伤流液中氨基酸浓度较低，可在原点上重点几次（注意每点样一次，吹干后再重复点样），样点吹干后备用。

（2）层析：取大小适当的层析缸一个，加入苯酚 ：水的混合液（比例为3 :1）50ml作为层析溶剂，或用正丁醇，冰醋酸和水的混合液（比例为40:10:50），然后将点好样品的滤纸挂入缸盖下，下端暂时不与溶剂接触。密闭缸盖，使滤纸与溶剂蒸汽平衡1 h后，将滤纸下端浸入溶剂，（注意点样点不能浸入溶剂，以免浸脱样品）。这时溶剂沿纸上升，待溶剂前沿距滤纸顶端还有2cm时，把滤纸从层析缸中取出，用铅笔在溶剂前沿处作上记号，然后悬在室内风干或在60～80℃下烘干。

（3）显色：滤纸干后，用喷雾器均匀地喷上0.1％的水合茚三酮乙醇溶液，略湿即可，然后在60℃～80℃烘箱中加热约10min，进行显色，此时有氨基酸处即呈现紫色斑点。

（4）鉴定：计算各点色斑的Rf值，并与标准氨基酸的Rf值相对照，即可鉴定出伤流液中氨基酸的种类。同时，根据各色斑的大小与颜色深浅，可约略知道各种氨基酸含量的多少。

2. 双向层析

双向层析适用于成分较复杂或分离较难的样品分析，且每张滤纸只能分析一个样品。

（1）点样：取两张20cm×25cm左右层析滤纸，在左下角离二边均为1.5～2cm处，用铅笔作上记号，用微量滴管或毛细管点样，一张点标准氨基酸混合液（约5μl）；另一张点伤流液，点样点大小以不超过0.3cm为宜。如伤流液中氨基酸浓度较低，可在原点上重复点几次（注意每次点样后须吹干）。样点吹干后，将滤纸卷成筒状，二边可用线缝合（中间留一空隙），如图所示。

（2）层析

第一次层析：取两个层析缸，加入苯酚 ：水的混合液（比例为3 :1）约50ml作层析溶剂，然后将点好样品的滤纸挂入缸盖下，下端暂时不与溶剂接触。密闭缸盖，使滤纸与溶剂蒸汽平衡1 h后，将滤纸下端浸入溶剂，（注意点样点不能浸入溶剂，以免浸脱样品）。经一段时间层析后，即待溶剂前沿距滤纸顶端还有2cm时，把滤纸从层析缸中取出，用铅笔在溶剂前沿处作下记号，然后悬在室内风干或在60～80℃下烘干，至无明显的溶剂气味为止。

第二次层析：将第一次层析的两张滤纸的线折开，滤纸调转90?，使原来的左边成为下边，再卷成筒状缝合如前所述。将层析溶剂改用正丁醇，冰醋酸和水的混合液（比例为40:10:50），其余层析方法与第一次层析相同。

（3）显色：第二次层析完毕，用喷雾器在风干的滤纸上均匀喷上0.1％的水合茚三酮乙醇溶液（略湿即可）。在60℃～80℃烘箱中加热约10min，进行显色。

（4）鉴定：显色完毕，用铅笔将各色谱和中心点描绘出来,然后量出由原点至色谱中心点和溶剂前沿的距离,计算出各种标准氨基酸和样品中未知氨基酸的色谱Rf值进行比较和鉴定。双向层析,其Rf值由两个数值组成, 即要在第一向和第二向层析中各计算一次, 根据Rf值及各氨基酸的特有颜色,将两张滤纸上的色斑进行对比，即可知道样品所含游离氨基酸的种类及名称。