离体法植物体内硝酸还原酶活性的测定实验
硝酸还原酶（NR）催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对－氨基苯磺酸（或对－氨基苯磺胺）及α－萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下： 生成的红色偶氮化合物在520nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以Nμg·g－1Fw·h－1为单位。
一、材料仪器设备及试剂
1. 材料：水稻或小麦的叶片、幼穗等。
2. 仪器设备：冷冻离心机；分光光度计；电子分析天平；冰箱；恒温水浴；研钵；剪刀；离心管；具塞试管；移液管；洗耳球。
3. 试剂及配制:
1μg·ml－1亚硝态氮标准母液配制：准确称取分析纯NaNO2 0.9857g，溶于蒸馏水后定容至1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1μg·ml－1的标准液。
0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液配制：称取Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g，加蒸馏水溶解后定容至1000ml。
1％对－氨基苯磺胺（W∕V）溶液配制：称取1.0g磺胺溶于100ml 3mol·L－1HCl中（25ml浓盐酸加蒸馏水定容至100ml即为3mol·L－1HCl）。
0.02％（W∕V）萘基乙烯胺溶液配制：称取 0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml蒸馏水中，贮存于棕色瓶中。
0.1 mol·L－1KNO3溶液配制：称取 2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液。
0.025 mol·L－1pH8.7的磷酸缓冲液配制：称取 8.8640g Na2HPO4·12H2O，0.0570g
K2HPO4·3H2O溶于1000ml无离子水中。
提取缓冲液配制：称取 0.1211g半胱氨酸，0.0372gEDTA溶于100ml 0.025 mol·L－1pH8.7的磷酸缓冲液中。
2mg·ml－1NADH（辅酶Ⅰ）溶液配制： 4mg NADH溶于2ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液中（临用前配制）。
二、实验步骤
1. 亚硝态氮标准曲线制作
（1）取7支15ml刻度试管，编号，按下表配制含量为0－2.0μg的亚硝态氮标准液。
加入表中试剂后，摇匀，在25℃下保温30min，然后以0号管为空白对照，在520nm波长处测定吸光度（A）值 。
（2） 标准曲线绘制
以1～6号管亚硝态氮含量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
2. 样品中硝酸还原酶活力测定
（1） 酶的提取
称取0.5g鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min，取出置冰浴中加少量石英砂及4ml提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中，在4℃，4000r/min下离心15min，上清液即为酶提取液。
（2） 酶促反应
取酶液0.4ml于10ml试管中，加入1.2ml 0.1 mol· L－1KNO3磷酸缓冲液和0.4mlNADH溶液，混匀，在25℃水浴中保温30min，对照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液代替。
（3） 酶活性测定
保温结束后立即加入1ml 1﹪磺胺溶液终止酶反应，再加1ml 0.02﹪萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000 r / min下离心15min，以空白管为对照，取上清液在520nm波长处测定吸光度（A）值。
三、 酶活性计算
根据样品所测得的吸光度（A）值，从标准曲线查出反应液中亚硝态氮含量，按下公式计算样品中酶活性：
