植物体内氧自由基含量的测定实验
在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自由基（O2－）。 利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中O2－含量。O2－与羟胺反应生成NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对－苯磺酸－偶氮－α－萘胺）。取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值可以算出样品中O2－含量。反应式如下：
一、材料仪器设备及试剂
1. 材料：花生、绿豆、大豆黄化幼苗的下胚轴及其他植物叶片。
2. 仪器设备：高速冷冻离心机，分光光度计，恒温水浴锅，研钵，试管，移液管，试管架，移液管架，洗耳球等。
3. 试剂配制：
50 mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）
1 mmol·L－1盐酸羟胺
17 mmol·L－1对氨基苯磺酸（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制）
7 mmol·L－1 α－萘胺（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制）
50nmol· ml－1NaNO2母液
二、实验步骤
1. 提取液制备
称取1g植物叶片放入冰浴的研钵中，加入50mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）5 ml, 研磨成匀浆，在1000r/min，4℃下离心10min，取上清液再以15000r/min，4℃下离心20min，第二次上清液即为样品提取液。
2. 亚硝酸根标准曲线的制作
2.1系列浓度NaNO2溶液的配制
取50nmol· ml－1NaNO2母液，分别稀释成0、10、20、30、40和50、nmol· ml－1的标准稀释液。
2.2取7支试管，编0～6号，分别加10、15、20、30、40、50、nmol· ml－1NaNO2标准稀释液1 ml，0号管加蒸馏水1ml，然后各管再加50mmol·L－1磷酸缓冲液1 ml，17 mmol·L－1对氨基苯磺酸1 ml和7 mmol·L－1 α－萘胺1 ml，置于25℃显色20min后，以0号管作空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。
2.3 标准曲线绘制
以1～6号管亚硝酸根（NO2－）浓度为横坐标，吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线。
3. O2－含量测定
取4支试管，编0～3号，1～号管分别加入样品提取液0.5 ml（三个重复），0号管加蒸馏水0.5ml，然后各管加入50mmol·L－1磷酸缓冲液0.5 ml，1 mmol·L－1盐酸羟胺1 ml，混匀，置于25℃ 1 h后，各管再加入17mmol·L－1对氨基苯磺酸1 ml和7 mmol·L－1α－萘胺1 ml，混匀，置于25℃显色20min，以0号管为空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。
三、结果计算
根据所测得的A530值，从标准曲线上查得样品中NO2－浓度，按公式（1）即可计算出样品中NO2－浓度。然后依据羟胺与O2－的上述反应，从NO2－对O2－进行化学计量，按公式（2）计算，即将按公式（1）计算得到的NO2－浓度乘2，得O2－浓度。也可根据被测样品与羟胺反应的时间和样品中蛋白质含量，按公式（3）求得O2－的生产率。
注意事项
如果样品中含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品液与羟胺温浴后，加入等体积乙醚提取叶绿素。
