培养细胞染色体显示法实验-人末梢血微量全血培养染色体显示法
显示人染色体过去主要取骨髓培养,利用其中干细胞能进行增殖显示染色体。末梢血淋巴细胞是已发生分化、处于功能态(G0 期)和无分裂活动的细胞。
但在PHA的诱导下,T淋巴细胞可重新进入增殖态发生细胞分裂。
为获得淋巴细胞可用多量血分离(10 ml)和微量全血培养两种方法。
多量血法较繁锁已少用,用微量全血培养法效果与多量血相同。每次从被检者静脉或指尖、耳垂等处仅采少量血(0.5 ml~2 ml),即可够做数个样品的培养,从而极大简化了观察人染色体的方法。
1. 培养液准备
取15 ml培养瓶数个,每瓶内分别充入5 ml培养液(pH 7.2),内含 1640 培养液(含10 %~15 %小牛血清)
PHA 0.1 ml
青霉素100 单位和链霉素100 μg/ml 培养液
2. 抽血针管准备
取2~5 ml 针管一支,在消毒后的无菌操作台或无菌操作箱中 安装好注射器,无菌抽肝素(100 U/ml BBS)少许湿润针管,如动作迅速不用肝素亦可;
3. 采血
用棉签沾75 %酒精给患者或献血者的皮肤消毒两次(勿用碘酒!),缚止血 带,静脉取血1~2 ml,无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0.4~0.5 ml;如系外 出采血,安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌条件略差的环境内操作,但动 作要迅速,以减少污染;在采血量不多或不应抽血的情况下,亦可在耳垂、手 指肚(无名指)用刺血针采血;
4. 培养和加秋水仙素
37 ℃温箱中培养到第60~72 小时之间,此时细胞分裂相最 多,向每培养瓶内加秋水仙素,最终浓度0.02~0.08 μg/ml营养液,再培养4~ 6 小时;
5. 低渗
1000 转/分钟,离心10 分钟后,吸除上清液,加入预温过的0.075 M KCl 溶液10 ml,置温箱中低渗处理15~20 分钟;
6. 其余步骤与处理传代细胞法相同。