免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

1、切片：阳离子防脱片！！！组织3.5um厚（如果选择一般载玻片，中间组织会脱掉，白费功夫）

2、脱蜡和水化：

 1）65度恒温箱（一楼西侧实验室第一间屋）中烤片1-2h，目的是让蜡充分融化；

 2）片子烤完后放入二甲苯I中15min，后更换二甲苯II中15min（二楼病理室通风橱中的研究生用二甲苯）

 3）无水乙醇5min，换95%乙醇5min，换75%乙醇5min（拿着无水乙醇的瓶子上二楼盛二甲苯中的片子，避免二甲苯味道四溢，目的是水化）

 4）去离子水洗3遍，每遍2-3min；

3、抗原修复（以水浴热修复为例，还有高压热修复、微波热修复、酶修复等）

 1）在片子水洗过程中，可以开始大火加热电磁炉到锅中水沸腾，锅中事先放好柠檬酸钠溶液小盒

 2）将片子放入柠檬酸钠溶液中（水处于沸腾状态），开始计时，并转成小火，锅盖可以少盖一部分，共15-20min即可

 3）室温放凉，也可以室温放一会转到冰水中继续放凉

 4）PBS溶液洗三遍，每遍2-3分钟；

 5）擦片平铺于湿盒中（里面提前加水），组画笔化圈（目的是保证接下来的溶液或试剂都尽量在圈中）

4、3%H2O2（二抗套装的白色试剂，一般写试剂1）滴加在组织上，室温静置10-15分钟；后PBS洗3遍；

5、配好一抗（抗体稀释液或PBS液按说明书上的IHC推荐比例稀释，一般要提前配好，放在4℃冰箱中，每片组织按大小估算用量，小标本一般50-100ul/片，大标本200ul/片）；

6、将一抗滴到每个标本上，保证覆盖范围大于组织面积，然后将标本连同湿盒放入4℃冰箱过夜（12-18h），也可以室温2h，但特异性不如过夜好；

7、PBS洗3遍，每遍10min；

8、二抗：（按说明书做）

 1）加入二抗黄色增强液15min；后PBS洗三遍；

 2）加入二抗红色试剂15-20min，后PBS洗三遍；

9、DAB显色：

 1）将DAB浓缩液和稀释液配好（一般比例是1ml稀释液：4-5滴浓缩液，试剂有毒，注意防护）；

 2）将片子放在显微镜下显色，出现阳性即停止（数十秒到数分钟不等，10分钟再没出现就是真没有，不用等了），事实上现在没有显微镜，用肉眼看也可以，找张白纸垫在片子下面，看到组织略棕色即可放到自来水中终止显色；

10、自来水洗净后的片子平铺于湿盒中，滴加苏木素5min；后自来水洗三遍；

11、盐酸酒精迅速浸泡，分化标本，后迅速放入氨水中30秒；后自来水洗三遍；

12、逆梯度酒精75%-95%-100%各1min；

13、二甲苯透明3-5min；

14、中性树脂封片；平铺通风放置后再镜下观察

免疫组化问题解答

1、染色过强
原因 解决方法
a 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜
b 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度
c DAB显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色
原因 解决方法
a 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟
b 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长
c 组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭
d 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间
3、染色弱
原因 解决方法 
a 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于60分钟
b 试剂超过有效使用时间 应更换试剂
c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液
使试剂稀释 （应防止切片干燥）
d 室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜
e 蛋白封闭过度 封闭不要超过12分钟
4、染色阴性
原因 解决方法 
a 操作步骤错误 应重试 设阳性对照
b 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果
c 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误