TRIzol 试剂是分离细胞和组织总 RNA 的即用型试剂，该试剂含有酚和硫氰酸胍单相溶液是 Chomczynsk i和 Sacchi进一步分离 RNA方法的进一步改进。在匀浆或裂解样本过程屮，TRIzol 试剂不仅可裂解细胞，而且可保持 RNA的完整。加入氯仿后离心，溶液则分为水相和有机相，RNA 绝大部分保留于水相，RNA 转到水相后，用异内醇沉淀以获的 RNA，移去水相后，样本中的DNA 和蛋白质吋用连续沉淀获得。用乙醇沉淀吋在中间相获得 DNA.异丙醇沉淀可在有机相获得蛋白质。该技术适于在人、动物、植物、细菌少量组织（50〜lOOmg) 和细胞（5X 1 0 4 以及大量组织≥lg )和细胞（5 X107) 中分离RNA，效果很好，整个过程可在l h 内完成。用TRIzol 试剂分离的总 RNA 没冇蛋白质和 DNA的污染，可用于 Morrhern blot 分析、斑点杂交、pdy ( A) 选择、体外翻译、RNase 保护分析、分子克隆等。TRIzol试剂易于分离不同大小分子质量的各 RNA，如从大鼠肝内分离的 RNA, 琼脂糖电泳后，在 7k b 和 15kb显示出了不同的高分子质量的 RNA 条带，两个主要的核糖体RNA带在约5kb (28S) 及约2kb (18S) 处；低分子质量的RNA在0.1〜0 .3kb(tRNA,5SRNA)n 分离的 R N A260/280 = 1 .6 〜1. 8。每毫克绀织RNA的产置为：肝和脾，6〜10 微克。肾3〜4 微克，骨骼肌和脑 1〜5 微克，胎盘 1〜4 微克。从 1X10^6 个细胞巾获得 RNA 的量是：上皮细胞，8〜15 微克；成纤维细胞5〜7 微克。现在已冇多种 TRIzol 类似产品可供使用。

氯仿    异丙醇    75%乙醇（用DEPC水配制）    无RNase的水（将水加入无 RNase 的玻璃瓶内，加浓度为0.1 % ( V/V)的DEPC过夜 ，尚压灭菌）    0.5%SDS溶液（必须DEPC处理过的高压灭菌水配制 ）   TRIzol 试剂

1 . 匀浆

1 ) 组织：每 50〜lO mg组织，加入1ml TRIzol试剂，用玻璃 -Teflcm 或电动匀浆器勾浆。样本体积不能超过 TRIzol 试剂的10%

2 ) 单层培养细胞：在 3. 5cm  的培养皿中加入 1ml TRIzol 试剂•用吸管抽吸细胞多次，直接裂解细胞。加入TRizol试剂的量取决于培养皿的大小（1ml/10cm^2）而不取决于细胞的量。TRIZol 试剂的量若不足，分离的 RNA 易受 DNA 污染。

3 ) 悬浮细胞：离心收集细胞，加 入 TRIzol 试剂屮反复吹打裂解细胞。动物,植物,酵母每 5X10^6～10×10^6 个细胞用lm] TRIzol 试剂。加 TRIzol  试剂前请勿洗涤细胞，因为这样会增加RNA的降解。可用勻浆器裂解细荫和酵母细胞。

2 . 相的分离

1 ) 匀浆后于 15 〜30 ℃放置 5min，以保证核蛋白复合体完全分离。

2 ) 加入 0.2m l 氯仿 /lm l TRIzol试剂。盖好样本管于 15 〜30℃用手剧烈摇动 15s ，放置 2〜3min。于2〜8° C小于12 000 g 离心 10mm。离心后、混合物分为三相：即最下层红色的酚-氯仿相，中间相以及上层水相&RNA绝大多数留于水相,水相体积用于匀浆的 TRlzol 试剂体积的 60%。

3. R N A 沉淀

1 ) 将水相移至一新管（若要分离DNA或蛋白质，保留有机相），加人异丙醇，混合均匀，以沉淀 RNA。每1ml TRizol试剂加入0.5ml 异丙醇，于 15〜30℃ 放置 10min

2)于2 〜8℃小于12000 g 离心 10min. 离心前，常看不到RNA沉淀，离心后 RNA 形成胶状颗粒物.沉枳在管的底部和壁上。

4. R N A 洗涤

1 ) 移去上清液，用 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀一次，每 1mlTRIzol 试剂至少加入加入1ml7 5 %  乙醇混匀，于2〜8℃7500g  离心5min。

 2 )弃上清

5.RNA溶解

1) RNA沉淀空气干燥 5〜l O min。勿在真空状态下离心干燥RNA，并注意勿使 RNA 完全干燥，因为这会大大降低其溶解性。若RNA未完全溶解，其  A260/280 <1.6

2 ) 加入不含 RNase 的水或 0, 5%SDS 溶液，反复吹打以溶解RNAg 如RNA较难溶解，可于 55〜60C 助溶 10min 1) RNA 产量低：其原因可能有以下几点：样本未完全匀浆或裂解；RMA 沉淀未完全溶解。

2)A260/280＜1.65 其原因可能有以下几点：样本太少；匀浆后，标本未室温放置水相受酚污染;RNA 沉淀未完全溶解。

3) RNA 降解：其原因可能有以下几点：从动物中取出的组织未立即加工或冻存；分离RNA的样本储存于 -5〜一20° C ,而不是一60〜一70℃：; 细胞被胰酶消化；溶液或管中含有  RNase;用于琼脂糖凝胶电泳的甲醛  PH < 3.L

4) DNA  污染：其原因可能有以下几点：样本太少；用于分离的样本含有机溶剂如乙醇、DMSO) 虽缓冲液或碱性溶液。

5 ) 蛋白多糖和多糖的污染：下列改进的 R N A  沉淀法（步骤3 ) , 可从分离的RNA中去除这些污染物。水相中每毫升 TRIzolml 加入0. 25m  l异 丙醇，再加 0. 25m l 卨盐沉淀液 (0.8mol/ L  柠檬酸钠 1.2mol/LNaCl) ,混合，离心，如前所述。这样可有效沉淀RNA 而蛋白多糖和多糖则留在液相。

6 ) 从少量样本(细胞≤14^4或组织≤10 mg)中提取RMA时，加入 0. 8mlTRIzol 试剂，匀浆后，加入氯仿，进行 RNA的分离，如步骤2。用异丙醇沉淀RNA前，加入 5〜10 微克无RNase的糖原。

7 ) 若样本中含有高浓度的蛋白质J 旨肪.多糖或细胞外物质，肌肉、脂肪组织、植物茎块，则需进行额外的分离。匀浆后，2〜12 000g 离心10mm, 将不溶性物质去除所得的沉淀包含有细胞外膜、多糖和髙分子质量的 DNA，上清液则含有RNA。来自脂肪组织的样本，脂肪聚集在上层，可去除.将处理好的匀浆液移至新管，如上所述，加氯仿进行液相分离.

8）匀浆后加氯仿前样本可于 -60〜一70℃  储存至少一个月。RNA沉淀可在75%乙醇 中 2〜8℃ 放置至少一个星期，一5〜一20 摄氏度至少放置一年。

9 ) 若在步骤2 ) 、3 )中，离心转速为 2600g,时间需增加到 20〜30min。

10) TRIzol试剂有毒，若与皮肤接触后，用清洗剂充分水洗。若感觉不适，应速去医院。TRIzol 试剂储存于 2〜8℃若室温储存，有效期为 12 个月。