2.1.3 哺乳动物细胞胞质RNA的分离
冰冷的磷酸盐缓冲液 (PBS) 137 mmol/L NaCl 2.7 mmol/ l KCl 4.3 mmol/l Na2HP04•7 H20 1.4 mmoI/L KH2PO4 pH7.3 冰冷的裂解缓冲液：50mmcil/LTris-HCl pH 8.0 lOOmmoL/L NaCl 5 mmoL/LMgCL21) 0.5%(V/V )NkmidetP-40 1000U/ml 胎盘 RNase 抑制剂如 ：RNasin 及 1 mmol/lDTT，用 DEPC 处理的水配制，过滤除菌 20% SDS 20 mg/ml 蛋白酶 K 酚 ：氯 仿：异戊醇 (25 : 24 : 1) 3mo]/L 乙酸钠 (DEPC 处理）pH 5.2 无水乙醇 75%乙醇/25% 0.lmoL/L 乙酸钠，pH 5.2 DEPC 处理的水
1) 收集细胞：①对于贴壁细胞，每 10 cm 的培养皿用 I ml 冰冷的 PBS 洗三次，再以小体积的 PBS 刮下细胞并转移到离心管中 ( 置于冰丄）3 00 g 离心 5 min 去上淸，冰上放置。
②对于悬浮细胞，以 3 0 0 g 离心 5m i n 收集细胞，去上清。再用一半体积冰冷的 PBS
重悬细胞，按前述方法离心并去上清。
2) 以 375 ul 冰冷的裂解缓冲液重悬细胞，冰上孵 5 min。在 _4℃ 用微型离心机离心
2 min 上清转移至一装有 4ul 20% SDS 的管中，立即振荡混匀。
3）加人 2.5ul 20 mg/ ml 的蛋白酶 K , 37℃ 温育 5 min
4 ) 加人 400ul 酚：氯仿：异戊醇，振摇 Imin。离心，上层水相转移至一干净管中，重
复抽提一次，再用 400ul 氯仿：异戊醇抽提一次. 上: 层水相转移至一干净管中。
5 ) 加人 40ul 3mol/l 乙酸钠 (pH5.2 ) 和 lm l 无水乙醇, 混合，冰上沉淀; 15〜30 min 或 一20 ℃ 沉淀过夜。
6) 于 4℃ 以 12 00 g 离心 15 min 。再用 1 ml 75% 乙醇/ 25½ 0.l mol / 1 乙酸钠
( PH 5.2 ) 洗涤沉淀。干燥后溶于 100ul DEPC 水中。取出一小份测定其浓度及纯度，其
余负 70℃ 保存
注意事项
1 ) 此方法一次可处理 2 X10^ 7 个细胞，每 10^7 个细胞可获得 30〜100ug RNA 。其
A260/080 应该在 1. 7〜2 . 0 之间。
2 ) 第二步操作重悬细胞时要小心操作，避免起泡沫,, 待悬液迅速变清，则显示细胞裂解完成。
3 ) 如果所收集的细胞转染过 DNA，可用无 RNase 的 DNase I 消化去掉污染的
DNA , 再按前述的方法用酚：氯仿：异戊醇及氯仿：异戊醇抽提回收 RN A 。
