磷酸盐缓冲溶液 (PBS)       硫氰酸胍溶液：4 mol/L 硫氰酸胍，0.lmmol/L Tris-HCl pH7.5，1%β-巯基乙醇         CsCl 5.7mol/：L (DEPC 处 理）       TES 缓冲液:0.1% SDS，10mmol/ LTris-ClpH 7.4 ，lmmol/ LEDTA         3 mmol/L 乙酸钠缓冲液 ( PH5. 2，DEPC处理）         无 水 乙 醇      经 DEFC 处理的水    离心机       6m l注射 器 及 20W 针头

1. 单层培养细胞

1 ) 室温 下 用 PBS 洗涤细胞，每 平 皿 5 ml 洗 涤 2 次 。

2 ) 在 不 超 过 10⁵ 个细胞中加人 3 . 5 ml 硫氰酸胍溶液，使之遍布整个平皿 。 用橡胶细胞刮于擦刮平皿，回收黏稠的细胞裂解液，用 装 有 20-G 针头的注射器往返抽吸裂解物，舍并在一起

2 . 悬浮培养细胞

1 ) 离心回收 ≤l0 ⁸ 个细胞，用 相 当 于 1 /2 原 有 体 积 的 PBS 重 悬 之 ，并再次离心回收细胞。

2 ) 往离心管中加人 3.5m l 硫氰酸胍溶液。

3 ) 用 装 有 20-G 针 头 的 6m l 注射器将黏稠的细胞裂解液往返抽吸 4 次 ，并将其移至一个干净的试管中。本 步 骤的重要性在于可对染色体 DNA 进行剪 切 ，以降低溶液的黏度 ，

4 ) 在 经 硅 化 井 高 压 过 的 13 mmX 51m m 的 超 速 离 心 管 中 ，加 人 1.5 ml5.7mol/LCsCl 并 在  CsCl  层 加 人 3. 5m l 细胞裂解液，界面应保持清晰。 1 )〜 4 ) 步的操作均在室温进行。

5) 于 18℃，150 OOOg 离 心 12〜 20 h(缓慢加速和减速）

6) 用巴斯德吸管的管尖在液面 1: 吸 取上 清 ，管子随液面的下降而下降。当吸至仅剩约 100u1 时 ，小心倒置管子,倒出剩余液体□在界面处应有一白色的 DNA 带 ，必须仔细地完全移去此带，因为它含有染色体 DNA。

7 ) 晾于沉淀约  5〜 lOmin，然 后 以 360ul TES 溶液重溶沉淀，反复用吸管上下抽吸，如此在室温逬行  5〜 lOmin，转移溶液于另一干净的微量离心管。

8) 加 人 40u1  3mol/L pH5. 2 的乙酸 钠 缓 冲 液 和 1m l 无水 乙 醇 ，在干冰/ 乙醇中沉淀30mim，离 心 10〜 15 min, 用  360 ul 水重溶沉淀并重复沉淀过程。

9 ) 沉淀晾干 lO min, 溶 解 于 20 ul 水 中 ，取 10 ul  稀 释 至  lml ，测  A260 和  A280.最 后 ，以水溶液或乙醇沉淀的形式在 一 70℃  储 存  RNA。 1 ) 要用足够的时间去重溶沉淀，否则 RNA 的产量会有显著下降。

2 ) 小 RNA 在 CsCl 中离心时不能有效地沉淀，因 此 不 能 用 此 方 法 制 备 5S RNA 和
tRNA 等分子。

3 ) 乙醇可以洗去沉淀中的氯化铯. 使沉淀易于溶解