一、试剂与器材准备
1. 试剂
（1）退火缓冲液：1 mol/L Tri-HCl(pH7.6)，l00 mmol/L MgCl2 和160 mmol/L DTT。
（2）通用测序引物：5'-d[CGTAAAACGACGGCCAGT]-3'，在水溶液中(5 pmol/ul)。
（3）T7DNA聚合酶(8 ug/ul)：在加有甘油的缓冲液中,应储于-20℃，用时吸取1份后迅速放回。稀释液可在4℃保存l周。
（4）酶稀释缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，5 mmol/L DTT，100 μg牛血清白蛋白/m1，5%甘油。
（5）标记用混合物(Labelling Mix)：dCTP，dGTP和dTTP各1.375 μm，333.5 mmol/L NaCl。
（6）模板：10 μg单链M13mpl8 DNA在50 μLTris-EDTA缓冲液中。
（7）"A"mixshort：dCTP，dGTP和dTTP各840 μmol/L，93.5 μmol/L dATP，14 μmol/L ddATP，40 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50 mmol/L NaCl
（8）"G"mixshort；dATP，dCTP和dTTP各840 μmol/L，93.5μmol/LdGTP，14 μmol/L ddGTP，40 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50 mmol/LNaCl。
（9）"C"mixshort：dATP，dGTP和dTTP各840 μmol/L，93.5 μmol/LdCTP，14 μmol/L ddCTP，40 mmol/L Tris- HCl(pH7.6)，50 mmol/LNaCl。
（10）"T/mixshort：dATP，dCTP和dGTP各840 μmol/L，93.5 μmol/L dTTP，14 μmol/L ddTTP，40 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50 mmol/LNaCl。
（11）终止液：溴酚蓝和二甲苯腈蓝FF各3%，10 mmol/L EDTA(pH7.5)，97.5%去离子甲酰胺。
（12）标记脱氧核苷酸：[α-32 P]dATP，10 mci/ml，3 000 ci/mmol。
（13）显影剂
（14）定影剂
2. 器材
恒温加热器或恒温水浴槽；涡旋振荡器；台式高速离心机；恒功率电泳仪；测序用电泳槽(附玻板及隔离条)盖革计数器；可调式加样器；微量离心管(Eppendorf管)；胶带；剪刀；手术刀；烧杯(100 ml)；梨形瓶(100 ml)；水泵；注射器(50 ml)；注射器针头(18号)；新华滤纸(3号)或Whatman滤纸(1号)；保鲜膜；凝胶干燥器材；抽气泵；增感屏；X光胶片；显影及定影用具。
二、单链模板与引物退火
1. 用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44 μg/ml)。
2. 取1.5 ml微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2 μgDNA/10 μl)10 μl；稀释通用引物2 μl；退火缓冲液2 μl，总体积14 μl。
三、链延伸/终止反应
1. 稀释T7DNA聚合酶：取2 μl(或4 μl)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5 μl(或1 μl)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽吸和排出而混匀，置冰浴中待用。
2. 另取4只微量离心管，分别用记号笔标明“A”、“G”、“C”和“T”。依次将A-Mix、G-Mix、C-Mix和T-Mix液各2.5 μl分别加入这4只微量离心管中，置37℃预温1分钟以上 (说明：4种mix液各又分为short和long两种，前者中ddNTP浓度较高，用于<500 bp的DNA片段的测序，后者用于50-1 000 bp片段的测序。一般应用short即可)。
3. 标记反应：在操作(1)的微量离心管中加入下列试剂：模板/引物14 μl(已有)；标记用混合物(1abellingmix)3 μl；已标记混合物(1abelled mix)1 μl，T7DNA聚合酶稀释液2 μl。总体积20 μl。轻轻混匀，简短离心，置室温5分钟，立即接下步反应。
4. 从“标记反应”混合物中，分别取4.5 μl加于4只预温的反应液中(注意：每一次转移均应换用新的吸头)，轻轻混匀。简短离心，37℃保温5分钟。
5. 向每只离心管中加入5 μl反应终止液，混匀，简短离心。
6. 变性反应：在电泳前进行。在上述链延伸反应终止后，最好即时进行变性反应并电泳，如不能及时电泳，终止反应后样品可储于冰浴或4℃。
7. 另取4只微量离心管，标好“A”、“G”、“C”和“T”。从上述每一链延长/终止反应的试管中取3 μl，分别加入4只已标号的相应微量离心管中，75-80℃加热2分钟，立即各取1.5-2 μl点样、电泳。
四、制备电泳凝胶及电泳
1. 制备胶模：取双块制胶玻板，先用泡沫海绵沾“洗洁净”液仔细擦洗，用水彻底淋洗，干燥后继用酒精清洗，晾干，再用硅烷剂(repel-silane)将玻板的―面擦一遍，蒸馏水淋洗，干燥 (注意：清洗时应戴一次性手套操作)。
将其中一块玻板平置台上(硅烷处理过的―面朝上)，两侧各放置一条隔离条(最好选用上方厚为0.2 mm，下方厚0.4 mm的楔形条)，另取―块玻板(硅烷化处理过的―面朝下)，对准放置在上述玻板上，两侧及―面边缘用胶带封严，并用文具夹夹紧，制成胶模。
2. 配制电泳凝胶：向1只100 ml烧杯中加入下列试剂；20%丙烯酰胺溶液20 ml；10×TBE缓冲液5 ml；46.7%尿素溶液25 ml。总体积50 ml(凝胶的丙烯酰胺浓度为8%)。混匀，过滤除去不溶物，置100 ml梨形瓶中连接水泵抽气5分钟，加入250 μl 10%过硫酸铵，50 μlTEMED混匀。
3. 注胶：立即将配好的凝胶用50 ml注射器小心注入制好的玻板胶模中(胶模宜倾斜45度左右)，注意防止气泡，如有气泡产生，可敲击该部位玻璃，使气泡上升排除。从上面插入梳齿背，深入胶面约10-12 mm。将胶模水平放置45-60分钟，待凝胶聚合。
4. 电泳：凝胶聚合后，拨掉梳齿，撕去玻板下缘胶带，用蒸馏水淋洗凝胶表面，以除去未聚合物质。将胶板装置在电泳槽上，上下槽加入缓冲液，注意排除凝胶下缘气泡。接通电源，40 W预电泳45-60分钟。预电泳结束后，断电。插入样品梳，梳齿向下插入凝胶中3 mm左右。用缓冲液小心冲洗每一加样小槽(齿间空隔)，用记号笔标明A、G、C和T4个小槽，每槽加入变性后的链延伸／终止液1.5-2 μl。接通电源，40 W恒压，电泳至示踪染料溴酚蓝至底边时切断电源。如待测片段较长而需继续点样，则等示踪染料二甲苯腈蓝称至距下缘4-5 cm时切断电源，用缓冲液冲洗另一组4个加样小槽(应与前一组相隔1-2个加样小槽)，重复上样操作，然后继续电泳至第2组示踪染料溴酚蓝移至玻板下缘时断电，停止电泳。
五、放射自显影及结果分析
1. 将凝胶板自电泳槽取下后水平放置，小心分离两块玻板，让凝胶完好地留在其中一块玻板上。可将凝胶切下一小角以示方向。
2. 在凝胶上小心地覆盖一张厚的3号新华滤纸，移去玻板，在凝胶另一面覆盖一张保鲜膜，注意排除气泡。滤纸面朝下置凝胶干燥器中干燥。
3. 于暗室中，将干燥的凝胶的保鲜膜面与一张X光底片的药膜面贴合，夹在增感屏盒中，置70℃或室温曝光4-16小时，然后显影、定影(按所用显影及定影剂说明进行)，水漂洗、干燥。然后由下而上读序。
注意事项
一、操作顺序参考表
1. 制备电泳凝胶(可在前一天下班前进行)。
2. 检查实验计划及试剂。
3. 预电泳。
4. 预电泳的同时进行引物退火、链延伸及终止反应。
5. 点样并电泳(根据需要可重复1-2次)。
6. 固定、干燥凝胶。
7. 放射自显影。
二、M13重组子的培养
1. 挑取单一的大肠杆菌集落加入3 ml LB培养基中，37℃振荡培养直至A600光密度达到0.8-1.0为止。
2. 取200 μl上述大肠杆菌培养物，加入含有2 ml 2×YT培养基的试管中，再将插入待测DNA片段的M13单一白色噬菌斑接种其中，在37℃剧烈振荡培养至少5小时，但不宜超过8小时。
3. 通过两轮离心将细胞除去，第2轮的上清液小心转移至另一清洁试管中。存放4℃待用。
三、单链模板的分离
1. 沉淀M13：在上述M13培养物上清中，加入0.2倍体积的3.5 mol/L醋酸铵/20%多聚乙二醇溶液，颠倒混匀数次，置冰浴30分钟。离心15-30分钟(11 000 g)可见白色噬菌体沉淀。小心除去上清液，可将试管倒置并吸去多余液体。
2. 分离纯化模板：向沉淀中加入TE缓冲液100 ul，轻轻混匀使沉淀重悬，(以下步骤可在微量离心管中进行)。再加等体积酚/氯仿试剂，旋转振荡30秒，离心1分钟使分层。小心将上层液转移至另―干净离心管中。用酚/氯仿重复抽提一次并转移上层液。
3. 加等体积氯仿，离心，转移上层液至洁净管中，并重复1次。
4. 加1/10体积3 mol、L醋酸钠(pH7.5)及两倍体积100%乙醇，混合，置干冰(或-40℃冰箱)中15分钟，离心10分钟，除去上清，加冰冷的70%乙醇l ml，离心，除去上清，于真空条件短暂干燥。
5. 加入20 ul Tris缓冲液溶解DNA沉淀，储于-20℃待用。
6. 用于测序的DNA，其A260/A280光密度比值至少应大于1.7。
