PCR技术
PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步,经过一定的循环,介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。
1. 调整模板浓度至10 ng/ml
2. 按下列体系配制反应混合液,混匀,加一滴矿物油,离心5秒
Template DNA (20 ng)2
buffer 2.0 ´10 μl
MgCl2(25 mM) 1.5 μl
lmPrimer F (10 mM) 0.2 μl
Primer R (10 mM) 0.2 μl
lmdNTPs(2 mM) 2.0 μl
Taq(5 U/μl) 2.0 μl
Add ddH2O to 20 μl
3. PCR反应循环条件设置:
95 ℃ 1 cycle
94 ℃ 55 ℃ 1' 72 ℃ 1'30" 35 cycles
72 ℃ 1 cycle
4 ℃ forever
溴酚蓝,混匀,短暂离心,取15 ml
4. 检测:加2 ml反应产物点样电泳;
5. 在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳;EB染色,紫外观察。