ISPCR扩增的产物的杂交和检测实验
1. 配如下杂交混合液
（1）2 μl 200 pmol/l 探针（终浓度4 pmol/l）
（2）50 μl 去离子的甲酰胺（终浓度50%）
（3）10 μl 20×SSC（终浓度2×）
（4）10 μl 100×Denhardt 溶液（终浓度10×）
（5）10 μl 10 mg/ml 经超声处理的鲑精DNA（终浓度1 mg/ml）
（6）1 μl 10%SDS（终浓度1%）
（7）7 μl 水
2. 加10 μl 杂交混合液于载玻片各样品孔中，样品孔中含有经原位PCR扩增的核酸。再于各孔上盖以盖玻片，放95℃加热块上加热5 min。
3. 载玻片放加湿盒中，于48℃温育2~4 h。
如用33P-标记探针：
4a. 移去盖玻片，在2×SSC中洗片5 min。
5a. 将载玻片浸于稀释的Kodak乳胶中。
6a. 晾干，然后在有干燥剂的闭光玻片盒中，放3~10天。
7a. 在暗室中，按下列程序对载玻片显影：
（1）依次浸于Kodak显影液，3 min
（2）水，30 s
（3）Kodak Unifix 定影液，3 min
8a. 在室温下，2%Gills 苏木精染液中，温育2~3 min，对玻片进行复染。
如用通过过氧化物酶检测的生物素或地高辛标记探针：
4b. 移去盖玻片，在PBS中洗片2次，每次浸洗5 min。
5b. 加10 μl 100 μg/ml 的链亲和素-过氧化物酶溶液于载玻片各孔中，轻轻盖上盖玻片，置37℃温育1 h。
6b. 移去盖玻片，在PBS中洗片2次，每次浸冼5 min。
7b. 在暗处，加100 μl AEC工作液于载玻片各孔，37℃温育10 min，然后镜下观察，如颜色不够强，再延长显色10 min。
8b. 以自来水浸冼玻片，然后晾干。
如用通过碱性磷酸酶检测的生物素或地高辛标记探针：
4c. 移去盖玻片，室温下，在2×SSC中冼片2次，每次浸洗15 min。然后加100 μl 封阻液于样品孔中，覆盖各孔表面，平放玻片于加湿盒中，室温下温育15 min。
5c. 对每一待显色孔，用10 μl 40 μg/ml 链亲和素-磷性磷酸酶结合物与90 μl 结合物稀释缓冲液混合。
6c. 用吸水纸接触载玻片边缘、吸去封阻液，每孔中加100 μl 按上步稀释好的结合物溶液，平放玻片于加湿盒中，室温下温育15 min。
7c. 于室温下，100 mmol/l Tris·Cl pH7.5/150 mmol/l NaCl中洗片2次，每次15 min，然后，于室温下，再以碱性磷酸酶底物缓冲液，洗片1次（5 min）。
8c. 在Coplin 广口瓶中预热50 ml 碱性磷酸酶底物缓冲液至加37℃，加200 μl 75 mg/ml NBT和166 μl 的50 mg/ml BCIP充分混合。然后，将玻片放此液中置37℃温育，直至达到所期望的显色程度。（通常需10 min~2 h，可间歇性地从溶液中取出玻片，在10×物镜下观察显色程度，但勿使玻片干涸）然后，将玻片浸于去离子水中终止反应，其间换水数次。
9. 室温下，以0.2% Gills 苏木精（如用于过氧化物酶的显色）或1%核酸固红染液（如用基于碱性磷酸酶的显色）染片5 min，浸玻片于自来水中，换水数次。
10. 室温下，依次将玻片置于50%、70%、90%和100%乙醇中，分别温育1 min 进行脱水， 然后晾干。
11. 毎孔加1滴固片介质，压上盖玻片，立刻进行结果观察（小心勿动盖玻片），或放室温过夜，使压片介质干燥。
图一、原位反转录/聚合酶链式反应。
图二、HIV-1感染的微管内皮细胞系的DNA-ISPCR。
