蛋白质的盐析分级分离及凝胶层析脱盐实验
用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体, 在高浓度的中性盐影响下脱去水化层, 同时, 蛋白质分子所带的电荷被中和, 结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解, 故蛋白质的盐析作用是可逆过程。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH 有关。分子量大的蛋白质(如球蛋白) 比分子量小的( 如白蛋白) 易于析出。改变盐浓度, 使不同分子量的蛋白质分别析出。 含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时, 小分子量的盐分子因进入凝胶颗粒的微孔中, 所以向下移动的速度较慢; 而大分子的蛋白质不能进入凝胶颗粒的微孔, 以较快的速度流过凝胶柱, 从而使蛋白质与盐分开。 蛋白质分子中具有芳香族氨基酸残基, 因此, 对280 nm 的紫外光有最大吸收, 且成正比, 符合Beer 定律。将分步收集的样品液于紫外分光光度计检测, 收集蛋白质样品。
1. 卵清蛋白的分离
(1)取卵清约2 ml 于试管中, 加等体积的饱和硫酸铵溶液,搅拌均匀, 蛋白质析出, 静置, 用滤纸过滤致滤液澄清, 沉淀即为卵球蛋白, 将此沉淀用2 ml 半饱和硫酸铵洗涤一次。
(2)将析出卵清球蛋白后的滤液放入试管中, 再加入固体硫酸铵使之达饱和, 观察有无沉淀产生, 若有沉淀, 则过滤之。滤出的沉淀即为卵清白蛋白。
2. 脱盐
(1)凝胶柱的准备: 称取葡聚糖凝胶sephadexG-25 5 g , 加入80 ml 洗脱液(蒸馏水) , 在沸水浴中溶涨30 min , 用倾泻法倾去悬浮的小颗粒。然后装进内径1 . 2 cm, 高30 cm 的玻璃层析柱内。注意装填均匀, 无气泡和裂纹存在, 并保持液面在凝胶床表面以上。
(2)加样与洗脱: 打开柱的出口, 让柱内液体慢慢流出, 直至液面与凝胶床表面相平。然后加入2 ml 含盐蛋白质溶液, 至样品液面刚好到达凝胶床表面时, 渐渐加入30 ml 洗脱液, 以0 . 5～1 ml/ min 的流速洗脱, 每5 ml 装试管分步收集。
(3)收集液的蛋白质含量可用280 nm 处的紫外光吸收法等检测。盐类可用离子呈色等方法鉴定。
(4)画出蛋白质280 nm 吸收曲线图, 将蛋白质溶液收集待用。
注意事项
1. 上述操作中加入固体硫酸铵的量可参看附录计算后加入。
2. 装柱加入凝胶时凝胶高度要达25 cm 高度左右, 否则由于容量小脱盐情况不好。
3. 测量后的样品不要倒掉, 收集蛋白质含量高的样品封口后于冰箱保存。
4. 使用过一次的凝胶柱, 进行平衡后可再次使用。但使用过多次的应进行再生处理( 低浓度碱浸泡30 min , 用水洗至中性, 低浓度酸浸泡30 min , 用水洗至中性, 装柱使用, 或加防腐剂于冰箱保存。
