凝胶过滤层析法测定蛋白质的分子量实验
凝胶过滤( Gel Filt ration ) 也称排阻层析( Exclusion Chromatography)、分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography ) 和凝胶层析( Gel Chromatography) 。凝胶一般是由葡聚糖的胶体溶液凝结而成的固体物质, 其内部具有很细微的多孔网状结构。凝胶层析的机理是分子筛效应, 当凝胶装柱后, 柱床容积称为“ 总容积” ( Vt ) , 它由Vo、Vi 、Vg 三部分组成, Vt = Vo + Vg ,式中Vo 为“外水容积”, 或“ 孔隙容积”, 即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相容积; Vi 为“ 内水容积” 即凝胶颗粒内部所含水相的容积, 相当于一般层析法中的固相容积, 它可以从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得; Vg 为凝胶本身的容积,Vt - Vo = Vi - Vg。“ 洗脱容积” ( Ve ) 是指自加入样品开始到组分最大浓度( 峰) 出现时所流出的容积, 它与Vo 及Vi 关系为: Ve = Vo - Kd Vi , 式中Kd 为样品在两相中的分配系数, 即分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数, 它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关, 而与柱形状无关, 对特定物质来说是一常数。对一层析柱凝胶床来说, 只要通过实验得知某一物质的洗脱容积Vo , 就可求出其Kd 值, 上式可以改写为Kd = ( Ve - Vo ) / Vi , 式中Vo 可用不被凝胶滞留的大分子物质溶液求得, 如蓝色葡聚糖-2000 ( MW =2000000 U) , 血红蛋白, 印度黑墨水等; Vi 可用g·Wr 求得( g为干凝胶重, Wr 为凝胶的吸水量, 以ml/ g 表示) 。 目前使用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶及琼脂糖和葡聚糖组成的复合凝胶。这些凝胶具有以下特点:化学性质稳定, 不与待分离物质发生反应, 没有或只有极少量的离子交换剂基团, 且有足够的机械强度。本实验用的是葡聚糖与还氧化氯丙烷通过交联反应制成的有孔颗粒状凝胶。交联程度越大孔径越小, 它不溶于有机溶剂, 能在水和电解质溶液中迅速溶涨。 不同型号的葡聚糖凝胶用英文G 表示, 如G-25、G-50、G-75、G-100 等, 后面的数字为凝胶吸水量乘以10。在实际工作中, 超细颗粒主要用于分辨率十分高的柱层析中, 细颗粒用于制备, 中等和粗颗粒用于低操作压下高流速的制备柱层析。根据凝胶层析的原理, 同一类型化合物的洗脱特征与组分的分子量有关, 流过凝胶柱时, 按分子大小顺序流出, 分子量大者走在前头。通常以Ka v ( Kd ) 对分子量的对数作图可得一曲线,称“ 选择曲线”, 曲线的斜率是凝胶性质的一个重要特征, 在一定范围内, 曲线愈陡分级愈好。在测定分子量时, 使用曲线的直线部分为宜。
1. 缓缓搅拌Sephadex 悬浮液, 然后慢慢倒入预先置好的层 析柱中, 使凝胶床达到2 . 5 cm×30 cm, 上端出口管用螺旋夹控 制。千万不能产生气泡。当凝胶已完全沉降后, 控制凝胶床上面 的液面在5 cm 左右。
2. 接着将待分离物质加到层析柱的上端(柱床上端的液面 降至使凝胶刚好露出为止) , 用移液管吸取待分离的样品, 并使 移液管尖端的位置大约在胶床上方的1 cm 处, 持好移液管, 勿 变动位置, 然后缓慢而连续地将样品释放到凝胶床上层。移开移 液管, 用10 ml 的试管放在部分收集器上收集从柱下端流出的溶 液, 此时控制流速在每4 秒钟1 滴( 相当于60 ml/ h )。
3. 当样品液刚好完全流入凝胶床时, 向柱上端很小心地添 加缓冲液至合适高度, 以保证流速的稳定。注意, 切勿搅动柱上 端的凝胶, 也不能使凝胶床上端无充裕的缓冲液甚至干涸。
4. 先收集28 ml 流出液, 再开始按每管4 ml 收集, 连续收 集并对每管编号, 当所有的有色物质均从层析柱中洗脱下来后, 关闭螺旋夹停止洗脱。然后在对应的波长下读各管的光吸收值。 葡聚糖( 650 nm 蓝色) ; 肌红蛋白( 500 nm 琥珀色) ; DNP-天冬 氨酸( 440 nm 黄色)。
5. 洗脱完最后一个谱带( 黄色) 后, 将1 ml 未知样品溶液 加到层析柱内, 先收集28 ml , 然后按前述方法开始每4 ml 一管 连续收集。如果蛋白质无色, 就在280 nm 波长条件下读光吸收 值。
【结果计算】
Kd 值的计算: 利用每管的光吸收值对管的编号数作图( 注 意前7 管里以28 ml 一次收集的, 第一个4 ml 管的编号应为8 ) , 应在每个峰位置标出测量波长, 画一个坐标图, 用观察法或算术 平均法确定每个峰的确切位置。算术平均法的计算式: 峰中点= 峰内每管编号乘以峰内连续各管的光吸收值之和, 再除以峰内连 续各管的光吸收值。
对1 ml 未知样品也按上述法做。计算出肌红蛋白的Kd 和未 知样品的Kd 值。
肌红蛋白和未知样品分子量的估算: 利用下表数据, 用已知 蛋白质的Kd 值(纵坐标) 对lgMW 作图, 再算出肌红蛋白和未 知蛋白的分子量。
在图中适当位置标明肌红蛋白和未知样品的Kd 和MW。
