醋酸纤维素膜电泳分离鉴定蛋白质实验
混合蛋白质样品中各种蛋白质的等电点不同, 在pH8 . 6 的巴比妥缓冲液中, 各种蛋白质所带的静电荷量不同, 加上蛋白质分子大小不相同, 在电场中移动的速度也不等, 例如, 血清或卵清样品中白蛋白等电点比其他蛋白质低, 在pH8 . 6 时带的负电荷比其他蛋白质多, 加上白蛋白的分子较小, 因此在电场中比其他蛋白质移动速度快。这样, 样品中的蛋白质在醋酸纤维素膜上就可以形成区带, 可以分离和分析蛋白质组成等。另外, 作为纯化了的蛋白质电泳后的区带应是一种, 否则就没有纯化好。醋酸纤维素膜是对纤维素的羟基进行乙酰化而得的, 将其溶于有机溶剂( 丙酮、氯仿、氯乙烯、醋酸乙脂等) 后抹成一均匀薄膜, 则成醋酸纤维素膜, 它有强渗透性, 对分子移动无阻力,作为区带电泳的支持物进行蛋白质电泳具有简便快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等优点。蛋白质与氨基黑10B 特异结合而不与醋酸纤维素膜结合,染色一段时间后脱色, 膜上没有结合蛋白质的部位就不呈色, 有蛋白质的部位就颜色明显。
1. 膜的准备: 将醋酸纤维素膜切成8 cm×2 cm 条块( 或根据需要决定薄膜大小) , 在薄膜一端1 . 5 cm 处用铅笔轻轻画一条线( 点样处) , 浸入巴比妥缓冲液中至完全浸湿( 大概20 min 左右)。用镊子取出浸透的薄膜, 夹在两层滤纸中间, 轻轻按压,吸去多余的液体。
2. 点样: 用较尖的血色素吸管或其他点样管吸取样品2～3 μl 涂在玻片的一端截面上(玻片宽度应小于膜宽度) , 然后将沾有样品的玻片截面与膜点样处轻轻接触, 样品即呈一条线“印” 在膜上, 使样品尽量点得细窄而均匀。
3. 电泳: 已点好样品的薄膜架在铺有滤纸桥的电泳槽上,使点样端靠近阴极, 膜用镊子轻轻拉平不能贴在槽底。盖好槽盖, 通电, 控制电流强度为0 . 7 ～ 0 . 8 mA/ cm 膜宽, 当白蛋白(仔细观察可见淡黄色) 移动约3 cm 即可切断电源停止电泳, 一般为40～60 min。
4. 染色和漂洗: 取下膜, 立即浸入染色液中10 min。取出移入2 . 5%醋酸中漂洗脱色, 每隔5 min 换一次漂洗液, 直至膜背景无色为止( 约更换3 次) , 即可观察到清晰的电泳图谱。
5. 透明处理: 待漂洗干净的电泳图谱完全干燥后( 可用电吹风机吹干) , 浸入透明液中0 . 5 min 后, 立即取出, 平贴在玻璃板上, 完全干燥后即成为透明的薄膜图谱, 可作扫描或照相。如将该玻板浸入水中, 则膜脱下, 吸干水分, 可长期保存。
