琼脂糖凝胶电泳分离 乳酸脱氢酶同工酶实验
乳酸脱氢酶( lactate dehydrogenase, 简称为LDH) EC ( 1 ,1 , 1 . 2) 存在于一切有糖酵解作用的细胞中, 在NAD+存在下催化乳酸脱氢形成丙酮酸或使丙酮酸还原成乳酸。其酶蛋白是由四个亚基组成的四聚体, 亚基有心脏型( H 型) 及肌肉型( M型) 两种。根据酶蛋白四聚体中H 型和M 型亚基比例的差别,可将LDH 同工酶分为五种, 即LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。亚基分子量相似, 为35000左右, 但带电荷情况不同,因此在电泳时有不同的电泳速度。本实验系用琼脂糖凝胶作支持介质, 在pH8 . 6 的巴比妥缓冲液中电泳, 将LDH 同工酶分离。以乳酸为底物, 在氧化型辅酶I 存在时, LDH 可使乳酸脱氢生成丙酮酸, 使NAD+ 还原成NADH2 , NADH2 又将氢传递给吩嗪二甲酯硫酸盐( PMS ) ,PMS 再将氢传给氯化硝基四唑蓝(NBT ) , 使其还原为蓝紫色化合物。因此, 有LDH 活性的区带即着蓝紫色。
1 . 凝胶板的制作: 将电泳洗净、干燥, 两边用胶带封口, 选好梳子并装好, 调节水平, 浇已熔化好的0 . 7%琼脂糖凝胶适 量, 冷至凝固, 然后移至4 ℃冰箱中放置30～50 min 后使用。
2 . 点样及电泳: 将电泳缓冲液加到槽中刚好盖上凝胶, 用 微量取样器加20 μl 血清样品(样品中或加入溴酚蓝指示剂) , 按4 ～5 mA/ cm 胶宽调节电流, 电泳大约40～50 min , 直至血清白 蛋白( 或溴酚蓝指示剂) 距胶终点1～2 cm 时停止电泳( 如果室 温比较高就在冰箱中电泳)。
3 . 显色: 将电泳后的凝胶放于带盖培养皿中, 用毛细滴管 加显色剂均匀铺凝胶上一薄层, 然后平放于37 ℃ 恒温培养箱中 避光保温60 min , 使同工酶各区带充分显色。
4 . 固定: 将显色后的凝胶板放入10%冰乙酸水溶液中固定 10 min , 倾去固定液, 蒸馏水漂洗2次, 洗去多余的显色液。
5 . 定量分析: 漂洗后的胶板, 用刀割下各区带, 分别移入 已放有3 ml 25%尿素水溶液的试管内, 混合, 置沸水中10 min , 待凝胶全部熔化后, 移至37 ℃水浴中冷却10 min 后比色。722分 光光度计, 波长560 nm, 蒸馏水调零, 记录各区带光密度值。计 算各区带的百分含量。计算方法为: 各区带光密度值除以各区带 光密度之和乘以100%。
注意事项
1. 在LDH 同工酶显色后, 往往在LDH1 前沿有一块桃红色的非特异性显色区域, 这不是LDH1 的组成部分, 定量时应去掉。
2. 溶血标本对结果有明显影响, 不能采用。
3. 本法也适用于各种体液LDH 同工酶测定。
