2. 蛋白质N-末端氨基酸的DNS 化
取0 . 5 mg 蛋白质样品, 置于有塞玻璃管中。用少量水溶解 后, 加入0 . 5 ml 0 . 2 mol/ L 碳酸氢钠溶液。再加入0 .5 mlDNS-Cl 丙酮溶液, 用三乙胺调至pH9 . 0～9 . 5 , 塞好塞子, 于40 ℃ 烘箱 中反应2 h , 或室温(25 ℃左右)放置2～4 h , 生成DNS-蛋白质。
3. DNS-蛋白质的水解
DNS 化反应结束后, 真空蒸去丙酮, 加入0 . 5 ml 6 mol/ L 盐 酸溶解DNS-蛋白质。全部移入水解管, 抽真空封管, 于111 ℃ 烘箱中水解18～24 h。开管后蒸去盐酸, 加少量水, 再蒸干。重 复2～3 次以除尽盐酸。
4. DNS-氨基酸的抽提
将上述水解产物, 加0 . 5 ml 水, 用1 mol/ L 盐酸调至pH2～ 3。加入0 . 5 ml 乙酸乙酯抽提, 分层可在细长滴管中进行。重复 抽提2～3 次, 将上层抽提液合并于小试管中, 抽去乙酸乙酯, 置于干燥器中备用。
5. DNS-氨基酸的层析与检测
生成的DNS-氨基酸和标准DNS-氨基酸分别进行聚酰胺薄膜 层析。
（1）聚酰胺薄膜的准备
将聚酰胺薄膜剪成7 cm×7 cm 的方块, 在距边0 . 5 cm 处画互 为垂直的两条基线, 交叉点为原点。若只做单相层析, 则只画一 条基线, 在基线上每隔1 cm 画一点样点。
（2）点样
用毛细管取样, 点在点样位置上, 点样直径应小于2 mm。 若多次点样, 则点一次, 吹干一次。
（3）展开
将点好样的聚酰胺薄膜卷成圆筒形, 样品则在筒内, 箍以线 圈固定。放在小层析槽内(可在小干燥器内置一培养皿代替) , 槽内( 培养皿) 放入5～10 ml 展开溶剂Ⅰ , 进行展开, 以溶剂前 沿到达距顶端0 . 5 cm 左右为止( 约20 min )。取出膜片, 吹干。 进行双向层析时, 在第一向层析完毕, 完全吹干(有时需晾过 夜, 才能充分吹干) , 将聚酰胺薄膜片转90°, 用展开溶剂Ⅱ 展 开。为了区分DNS-苏氨酸或者区分DNS-天门冬氨酸与DNS-谷 氨酸, 可在溶剂Ⅱ展开后, 吹干, 接着用溶剂Ⅲ沿同一个方向展 开, 只需展开至一半高度即可。为了区别ε-DNS-赖氨酸、α- DNS-组氨酸与DNS-精氨酸, 应在溶剂Ⅱ 中展开后, 吹干, 接着 在溶剂Ⅳ中沿同一个方向展开。
（4）DNS-氨基酸的检测
展开结束后, 取出薄膜, 用电吹风机吹干, 在360 nm 或280 nm 的紫外灯下检测。DNS-氨基酸呈黄色荧光。此外还有其他颜色 的杂点, 如DNS-OH 显绿色荧光等。用样品的层析谱与标准 DNS-氨基酸层析谱相比较, 可鉴别样品DNS-氨基酸的种类。
