核酸的定量测定实验-紫外分光光度法
核酸、核苷酸及衍生物都具有共轭双键系统, 能吸收紫外光, RNA、DNA 的紫外吸收高峰在260 nm 波长处。一般在260 nm 波长下, 每1 ml 含1 μg RNA 的溶液光吸收值为0.022 , 每1 ml 含1 μg DNA 的溶液光吸收值约为0.020 , 故测定未知浓度RNA 或DNA 溶液在260 nm 的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便、迅速。若样品内混有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质, 则测定误差较大, 故应该先除去。
1. 用分析天平准确称取待测的核酸样品500 mg , 加入少量蒸馏水调成糊状, 再加入少量的水稀释。然后用5% ～6% 氨水调至pH7 , 定容到50 ml 。
2. 取两支离心管, 向第一只管内加入2 ml 样品液和2 ml 蒸馏水, 向第二只管内加入2 ml 样品液和2 ml 沉淀剂( 以除去大分子核酸) 作为对照。混匀, 在冰浴中放置30 min 后离心( 3000 r/ min) , 从第一、第二管中分别吸取0.5 ml 上清液, 用蒸馏水定容到50 ml。用光程为1 cm 的石英比色杯于260 nm 波长处测其光吸收值( A1 和A2) 。 【结果处理】
DNA (RNA)% = [ (A1 - A2) / 0 . 020 (或0 . 022 ) ] (μg/ ml) ×100/ 样品浓度(μg/ ml ) 样品浓度= 500 mg/ ( 50 ×4/ 2 ×50/ 0 . 5) ml = 50 μg/ ml。
