DNA文库的构建及其筛选
1.水稻 DNA 的提取水稻 DNA 的提取参照 Dellaporta, Wood 和 Hicks (1983) 法分离总基因组DNA并略有修改。 通过 0.8% 琼脂糖凝胶电泳测定分子量。
2.基因文库的构建。以限制性内切酶λEcoRI 消化水稻基因组 DNA12 h, 然后从胶中回收 0.5~ 8kb片段, 连接到λExCell EcoR I/ CIP载体上, 体外包装并感染受体菌NM522。
3.基因文库的鉴定。挑取 50个新鲜的白色噬菌斑, 分别加入 150ul SM buffer , 按λExCell 试剂盒说明书进行质粒释放, EcoRI 酶切鉴定基因组 DNA 插入片段的大小。
4.水稻基因组。DNA 的非同位素标记标记程序按地高辛标记检测试剂盒探针标记程序进行。
5.噬菌斑原位杂交。噬菌斑转膜、固定均参照分子克隆方法 。预杂交, 杂交以及高灵敏度的洗涤尼龙膜均在杂交炉 (Biometra) 中进行。杂交信号的检测按照 Boehringer Mannheim 的使用说明书进行。
6.点渍杂交。选取噬菌斑原位杂交信号较强的 200 个克隆进行质粒释放。 质粒释放程序参照λExCell 试剂盒说明书进行。 然后按碱裂解法小量提取重组质粒。将 200 个重组 DNA 各取 1ul 依次点在尼龙膜 上, 固定后以 Dig 标记的基因组 DNA 为探针进行点渍杂交。 从中选取 40 个杂交信号较强的重组子, 再次进行斑点杂交。
7.Southern 杂交。选取第三轮点渍杂交信号强的 10 个重组子标记为探针. 基因组 DNA 酶切采用 5 种常用的限制性内切酶: EcoRI、H indIII、BamH I、Bg lII 和 PstI。常规琼脂糖凝胶电泳分离, 通过电转 移仪将酶切片段从琼脂糖凝胶中转移到尼龙膜进行 Southern 杂交。
