家兔椎间盘细胞培养实验
首先建立家兔椎间盘细胞的体外培养系统，其中，第一组给予纯氧，另外3组给予不同浓度的臭氧：30 μg/ml，60 μg/ml和80 μg/ml，然后于15 min及30 min后，采用台盼蓝细胞排斥试验计算椎间盘细胞的活细胞率。
一、实验步骤
1. 组织块贴块法
（1）取材：空气栓塞法处死家兔后，在无菌状态下获取家兔椎间盘组织。置于准备好的DMEM 培养基(含双抗)。迅速带回到无菌超净台上。
（2）剪切：在超净台上，进一步将周围组织分离，用Hanks’液冲洗数遍，直到冲洗液透明为止。眼 科剪刀将组织修剪为1~2 cm3 大小的小组织块，Hanks’冲洗干净。加入少量含血清的培养液。(组织块不宜过小，否则不容易爬出足够数量的细胞)。
（3）接种：用吸管吸取小组织块入培养瓶底部，摆放均匀，一个25 cm2 的培养瓶可放置10-15 个小组织块，翻转培养瓶，加入少量培养液。4~6 小时后，待组织块充分贴壁后，再翻转回来(动作一定要轻巧， 以免刚刚贴壁的组织块脱离瓶底)。
（4）于5% CO2 孵箱中培养，每隔 3 天换液。待细胞 95%融合时，0.25%胰蛋白酶传代分瓶。
2. 酶消化法
（1）前面步骤同组织块贴块法 1、2。
（2）组织块再进一步剪切，此时培养液中最好不加血清。
（3）完毕后，加入消化液，移入到10 ml 离心管，培养箱内消化。
（4）每隔20 分钟，用吸管吹打一次，观察液体有否变浑浊，并取少量液体，在相差倒置显微镜下观察。
（5）0.4%台盼兰染色计算活细胞数目。
（6）接种密度在105 数量级。置于5%CO2 孵箱中培养，每隔 3 天换液。
（7）待细胞 95%融合时，0.25%胰蛋白酶传代分瓶。
二、结果
IVD 细胞为类软骨细胞，描述：单层细胞形状不规则，可呈三角形、多角形，梭形及不规则形。不同于成纤维细胞。如下图：
图1：组织块贴块法
图2：传代细胞形态
图3：细胞传代前状态95%融合
注意事项
1. 椎间盘位于相邻两个椎体之间，取材过程较为繁琐， 要求动作迅速，争取在家兔死后半小时内完成，否则，该组织对缺氧耐受性差导致培养失败。
