一、实验材料准备 1. 实验用具及材料
2. 相关溶液的配制
（1）20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g柠檬酸钠，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH调pH 至7.0）。
（2）去离子甲酰胺（DF）：将10 g混合床离子交换树脂加入100 mL甲酰胺中。电磁搅拌30 min，用Whatman l号滤纸滤。
（3）体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35 mL甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。
（4）体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100 mL甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。
（5）体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
（6）杂交液：8 μL体积分数25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL体积分数50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O混合）取上述混合液50 μL，与5 μL DF混合即成。其终浓度为体积分数10% DS，2×SSC，体积分数50% DF。
（7）PI/antifade溶液
PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL双蒸水，使终浓度为2.5 μg/mL。Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10 mg/mL，用0.5 mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混匀。
PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1:9比例充分混匀，－20℃保存备用。
（8）DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液，按体积比1:300，以antifade溶液稀释成工作液。
（9）封闭液I：体积分数5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。
（10）封闭液II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。
（11）荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。
（12）洗脱液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。
二、实验方法及步骤
1. 探针变性
将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。
2. 标本变性
（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。
（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3 min。
（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。
3. 杂交
将已变性或预退火的DNA探针10 μL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
4. 洗脱
此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
（1） 杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2） 将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5 min。
（3） 在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5 min。
（4） 在室温下，将玻片标本于2×SSC中轻洗一下。
（5） 取出玻片，自然干燥。
（6） 取200 μL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）
（1） 在玻片的杂交部位加150 μL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
（2） 去掉保鲜膜，再加150 μL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40 min。
（3） 取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5 min。
（4） 在玻片标本的杂交部位加150 μL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20 min。
（5） 去掉保鲜膜，加150 μL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40 min。
（6） 取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5 min。
（7） 重复步骤（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室温清洗一下。
（8） 取出玻片，自然干燥。
（9） 取200 μL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
6. 封片
可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。
7. 荧光显微镜观察FISH结果
先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490 nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。
所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择
