含有目的基因真核表达 pEGFP-C1载体的构建实验-质粒提取

1. 挑取含有目的DNA重组体的单个菌落接种在3 ml LB（含有Amp或Kan）液体培养基中，37 ℃，225 rpm培养12～16 hrs。

2. 提取质粒

⑴离心菌液，废弃上清。

⑵加入250 ul Buffer P1，使菌片重悬，务必使片状物不可见。

⑶加入250 ul Buffer P2，上下颠倒EP管4～6次，操作时间要少于5 min。

⑷加入350 ul BufferN3，上下颠倒EP管4～6次，可见絮状沉淀。

⑸离心13000 rpm，10 min。

⑹离心后的上清液移入PrepSpinColumn。

⑺13000 rpm离心30～60Secs，弃滤液。

⑻加入0.5 mlBufferPB，13000 rpm离心30～60 Secs，弃滤液。

⑼加入0.75 mlBufferPE，13000 rpm离心30～60 Secs，弃滤液。

⑽13000 rpm再离心1 min，弃滤液。

⑾将PrepSpinColumn加到新的1.5 mlEP管上。

⑿加50 ul BufferEB至滤膜中央，室温静置1 min，13000 rpm 离心1 min。即获得所需质粒。

3. 酶切鉴定

反应体系（20 ul 体系）：

反应条件： 37 ℃ 2-3 hrs

4. 电泳：观察酶切结果。