在上一节教程中我们已经设计好构建p53表达载体的引物：

构建p53表达载体（1）——引物设计

现在引物已经到手~在这里我们接着做。

1. 将引物配成溶液

     我们从引物公司订购回来的引物一般使用EP管包装的粉末状，一般量为2OD，因为非常少，所以肉眼仅可见。在随同发过来的引物外一般还有一张说明书，是对引物的描述，有引物的长度，退火温度，需要加多少ddH2O。

    在打开引物的EP管盖之前一定要离心一下，让漂浮在EP管仲的引物粉末沉降下去。然后我们按照说明书添加对应体积的ddH2O（至于加什么水，本科研狗什么水都加过，高压水，dH2O，甚至自来水，当然最好是用比较纯的水，水中的离子会影响PCR酶）。引物的储存液一般是配成100mM，我们再从里面配出一些工作液10mM，然后把储存液放置-20度保存（避免反复冻融）。

2. 提取细胞的总mRNA

我们从细胞中提取总mRNA，提取mRNA 的方法一般是用Trizol方法提取，RNA的提取方法可以查看科研狗网站http://www.keyangou.com/protocol

注意，p53在很多肿瘤细胞中存在突变，因此需要选择没有突变的细胞，（最后我们将测序验证构建的质粒是否有突变）。

3. 将提取的总mRNA 逆转录成cDNA，这里我们采用试剂盒。

4. 采用步骤1里面的引物对步骤3里面的cDNA进行PCR，根据PCR使用的酶厂家不一致，调整Buffer和水，下面仅仅是一个例子：

Primer-forword:         10mM          0.5ul

Primer-reverse:         10mM          0.5ul

2xBuffer:                      -                  12.5ul

dNTP:                         2.5mM          3ul

template                     50ng/ul          2ul

DNA聚合酶                 -                   0.5ul

H20                                                   6ul

总体积                                              25ul

根据你使用的PCR反应体系调整，第一次PCR可以对模板浓度做一个梯度，比如50ng, 100ng, 500ng。 退火温度为Tm值-5度。延伸时间一般为1kb长度对应1分钟，p53大约有1500个碱基，那么延伸时间设置为1分钟30秒，总共35个循环。

5. PCR结束之后，需要跑DNA琼脂糖胶进行分析，pcr产物大概在1500bp，我们使用0.8%或者0.1%的琼脂糖胶。Marker使用1Kb的marker.。

琼脂糖跑胶大约需要20分钟到30分钟，之后我们在凝胶成像系统下观察PCR产物是否扩增出来了p53的片段。

6. 接下来我们选取步骤4里面最好的条件，再PCR三管。然后我们把所有的PCR产物用琼脂糖凝胶跑胶回收。最后用水溶解的，不要使用TE，因为TE会对后面的酶切产生影响。

7. 回收结束之后用仪器测浓度，如果没有很好的仪器，也可以直接跑胶估测浓度，一般的marker上5ul，最亮的条带为100ng，其他的条带为50ng，可以根据条带亮度估计。回收的DNA片段最好总量超过2ug。

8. 采用我们先前设计的两个酶XhoI和NotI分别对回收之后的PCR产物和PCI-neo质粒进行酶切。酶切一般的总体积为30ul，如果你的PCR产物回收之后浓度比较低，可以总体积为50ul，酶切体系最好是在0.2ml 的PCR管里面进行，放置于37度水浴过夜（16h）酶切体系如下：

9. 第二天，把PCR产物管和载体管立即分别进行琼脂糖凝胶电泳回收，参考第6步。回收之后依然测下浓度。有的人员喜欢加上CIP酶处理，本科研狗一直没加，可以看看自己情况添加。

注意：在跑质粒的时候可以在琼脂糖旁边上一个没有经过酶切的质粒对照，质粒经过双酶切之后变成线性的了，PCI-neo载体总碱基数大约为5500个，如果经过酶切之后，在琼脂糖上面的位置也应该在5500左右，没有经过酶切的质粒是超螺旋结构，应该在3000-4000左右。另外即使跑出来的条带在5500左右，也只能证明其至少被一个酶切开，我们不能判断其是否被两个酶同时切开。

10. 接下来就是连接，我们需要把p53的DNA片段连入PCI-neo上面。我们使用T4 DNA ligase，连接体系如下。

注意：载体和DNA片段的数目比最好在1:3到1:10 ， 是数量比，不是质量比，PCI-neo载体大小为5500, p53的DNA片段约为1500，因此上图中所加的片段比为1:7。连接的DNA总量不要超过100ng。

11. 四度过夜连接之后，进行转化涂板，我们一般用热激法进行性转化，采用的是大肠杆菌DH5a，我们将所有的10ul连接产物转化。

12. PCI-neo是氨苄抗性质粒，因此我们选择把转化后的产物涂在含有100ug/ml的氨苄菌板上，然后37度细菌孵箱过夜。

13. 第二天会在菌板上长出克隆，如果克隆不够大，可以继续放在37度，如果已经很好，但是又不想立即挑克隆摇细菌，可以放在四度。取15ml玻璃摇菌管6只，加入带50ug/ml氨苄抗生素的LB培养液5ml，挑取6个克隆，37度摇床过夜。

14. 接下来可以直接送菌液测序，不过最好是先取1ml菌液小提质粒，然后跑胶之后确认质粒位置正确后送测序

测序的时候需要提供测序引物，如果你写明载体为PCI-neo载体，测序引物可以直接写通用引物。一个测序引物能够测出800bp左右的序列，p53载体有1500个，那么写双向测，两个反应则可以把p53测通。

15. 等待一至两天后结果会发送到你的邮箱，就可以进行序列比对，序列比对可以采用多种软件比如clusterX，也可以使用NCBI网站，序列比对我们将在以后的章节中介绍。

至此两节教程介绍了从如何设计引物到最后的测序~希望对大家有所帮助。