总的原则：无菌操作、保证细胞培养环境的稳定性

按时间顺序整理

1、 细胞房和生物安全柜（或超净工作台）先开紫外照射30min。作用：对环境灭菌（空气）。（备注：如果着急，至少也要开15分钟）

在做实验之前考虑好需要哪些物品。开始照射之前，将所需要用到的物品都放到生物安全柜（或超净工作台）里面。

常用移液枪或电动移液器等，需要在工作台上放置一套专用设备。

细胞培养箱一般都已经调整好。定期留意一下二氧化碳是否足够。不够及时更换。

2、 显微镜需要定期消毒酒精擦拭。注意：显微镜一般都放在细胞房。

3、 进入实验之前，首先给自己带上拖鞋、头套，口罩，实验服，手套（手套带双层）。注意：手套要将袖口套进去。实验服、拖鞋最好是细胞房专用。

4、 开始操作之前先观察细胞。

首先观察细胞培养液的颜色。现在的细胞培养液通常都放有酸碱指示剂（绝大部分是酚红）。细胞在培养生长过程中，不断在培养液上清中累积酸性物质，时间长了，培养液变为黄色（同时培养液中营养物质耗尽）。

其次镜下观察细胞的生长状态是否良好，是否需要传代。如果生长状态不好，需要对培养液进行调整（一般是加大血清浓度）。过于密集出现大片融合或太密集而导致细胞脱落，则进行传代。

如果长势良好，且细胞培养液颜色未发生变化，可以酌情进行1/2、 1/3、1/4换液，也可以全换液。总之，视细胞生长情况而定。

5、 细胞培养预准备：

首先是准备各种溶液。

第一是配制溶液过程中要用到的水。水用纯水，高压灭菌之后，再去内毒素。去内毒素方法很多，最简单可以放在烘箱180度3小时。或者过去内毒素的柱子后，高压灭菌。

第二，各种溶液灭菌：

抗生素用去内毒素水配制后，直接过滤除菌（过0.22u滤头）。可以用一次性无菌注射器过一次性0.22u滤头。

现在用的培养液，如果是商业化液体培养基，不用处理。如果是粉末，需要用去内毒素水在生物安全柜（或超净工作台）进行配制，再过滤除菌。可以先配浓缩液（如10×），过滤除菌后。再用灭菌去内毒素水稀释成1×培养液。

第三，完全培养液的配制：

培养液加上合适比例的血清即可。但血清一般保存于－20℃，一般解冻是放在4℃冰箱解冻，耗时长，而且必须解决完全之后，才能进行完全培养基的配制。所以要提前几个小时就将血清从－20℃转入4℃，以期完全解冻。当然如果这一次就需要用完的话（是指用这些血清配制的培养液都用完），也可以放到37℃解冻。

第四，最重要的是保证过程中无菌。

液体必须要分装。无论过程中用到的培养液、胰酶、血清、PBS、生理盐水、抗生素尽量分装。分装是为了防止污染。如果操作有误，仅能威胁到其中一支，而非整个。

培养液、血清、PBS、生理盐水分装为20mL、50mL或100mL/管

胰酶、抗生素可分装为1mL/管。

分装最好先于细胞操作

第五，操作之前，培养液先放到37度的细胞培养箱里复温。原因：尽量减少对细胞的刺激。低温对于细胞也是一个刺激因素。

第六，操作之前，大脑先过一遍此次操作所需要用到的所有用具。将所有用具先放到无菌台面上。减少拿入拿出的动作，保证无菌。（如果万一发现少拿了什么，也不要紧，再加上就是。如果是枪头盒、移液管等用具，最好先用消毒酒精喷一下）。

第七，操作之前，带着的手套先喷消毒酒精。然后再进入工作台。等一分钟，等手套上的酒精挥发之后再进行操作。

6、 细胞培养操作过程：

注意无菌。无论哪一管液体，开盖后尽量立即关上（如果有几瓶都需要开的，也注意，可以虚盖）。盖子向上放。操作时不要从开盖的容器上方经过。另外，无菌台面上摆放的各种东西，最好是一字摆开，平行于自己。尽量不要前后重叠。

细胞操作中所用的所有耗材试剂最好都是细胞培养专用。一般都以一次性耗材居多。1ML枪头为加长型专用培养枪头。移液管亦有专用10mL一次性无菌移液管

（1）细胞换液：

培养皿/瓶用枪头或移液管吸去原培养液，加入新培养液。

（2）细胞传代：

传代之前先观察，细胞是否密集，是否开始融合。一般融合达到70－80%就可以传代。早点传代也可以。

如果是贴壁生长的细胞：

1） 培养皿/瓶用枪头或移液管吸去原培养液；

2） 无菌PBS或无菌生理盐水洗涤3次（按培养体积加入）；

3） 加入适量胰酶消化适当时间（一般胰酶为0.25%；9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶，一次加入1mL胰酶。消化时间视细胞类型等多种情况综合考虑，一般如果是细胞株，非原代培养，消化1－2分钟足矣）；

4） 用枪头吹打数十次（视细胞类型而定。一般细胞株30－50次吧，耗时一般2分钟左右）；

5） 加入适量体积完全培养基终止胰酶消化（如果是9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶，可以加入1mL完全培养基；现在培养瓶（皿）里有2mL溶液）。

6） 现在可以将溶液进行分瓶（2mL）。如果是细胞株，直接均分到两个培养瓶（皿）里。如果是原代培养，可以根据消化时间来对细胞进行分离；因此可以将溶液（2mL）都转入新的培养瓶（皿）。

7） 将两个培养瓶（皿）补足完全培养基到正常体积（果是9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶，为5mL完全培养液）

8） 镜下观察。刚刚传代细胞还没贴壁，悬浮在溶液中，呈圆形。一般2h之内会贴壁，如果已经贴壁，根据细胞类型有不同的形态，但通常都不是圆形。

9） 镜下观察无误之后，再放入细胞培养箱。培养瓶（皿）放入之前，可以用消毒酒精先擦一下。

10） 传代之后，最好第二天细胞换液一次。当然，也可以视情况而定。

7、 收拾工作台。物品归位，倒出垃圾。再开紫外照射30min

8、 其它注意事项：

第一，经常观察。最好是每天都显微镜下看一看，确定细胞状态。然后该换液换，该传代传，不用理会的就原样放回去。如果好几天都不想理会，可以放不完全培养基，或者低血清浓度的培养液，维持细胞生存，但不增殖。

第二，是否加抗生素。这个视情况而定。细胞培养过程中，是要求尽量少添加不相关的杂质。抗生素对于细胞来说，也是一种负担。但如果环境比较污染，直接添加好了。好比没病不用吃药，感冒了还是要吃药；婴儿没病但还是要打疫苗。

第三，胎牛血清的解冻。血清一般保存于－20℃，要放在4℃冰箱解冻，耗时长，500mL要好几个小时，我们经常是头天离开实验室之前放到4℃冰箱，过夜。所以经常分装成10mL或者20mL。这样，上午放到4℃冰箱，下午就可以用了。

第二，是否一定要细胞房。以及是否要完全严格的遵守种种器具专用。这个吧，见仁见智。凡所有种种措施及设备都是为了保证培养操作过程中无菌，减少感染的机率；专用试剂耗材保证无菌无内毒素。细胞房也是这么一个措施而已，其它试剂耗材也是；我们没有专门的细胞房也这么养。

并不是说走夜路就一定会遇到鬼，当然走多了迟早遇到，如果总是遇不到，这个人运气一定很好——可以去买彩票。

刚开始我们实验室也是没有专用的生物安全柜和细胞房，拖鞋什么的也没办法专用，没有加抗生素，照样养得好好的。但是，交叉养，还是需要注意，一是时间上分隔开来：每天细胞培养先操作。其它细菌之类操作靠后，且操作后消毒酒精台面消毒，紫外照射1小时。二是其它操作要小心，避免带入污染。当然，如果有必要加抗生素，还是尽早加，比细胞污染了再去抢救要来得好。