单克隆抗体的商业化生产已经彻底改变了许多疾病的治疗，包括癌症、多发性硬化症和类风湿性关节炎。这些生物疗法有可能在全球产生超过1500亿美元的年收入。两种细胞宿主主要用于产生这些单克隆抗体：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和小鼠骨髓瘤细胞（NS0）。到2017年，市场上近四分之一经批准的单克隆抗体是使用NS0宿主细胞系生产的，约三分之二是在CHO细胞中生产的。有几种不同的表达平台可供选择：CHO-GS（谷氨酰胺合成酶）、CHO-DHFR（二氢叶酸还原酶）、NS0和GS-NS0，它们已在细胞系和过程发育方面得到表征。尽管细胞培养基的主要成分对于CHO和NS0细胞来说是共同的，但是特定的生长培养基已经根据个别细胞的需要进行了修改，例如NS0细胞的胆固醇。

一、哺乳动物细胞的培养历史

1. 哺乳动物细胞系的建立

1951年，第一个人类“转化”细胞系是由一名宫颈癌患者死亡而开发的，该细胞系被命名为HeLa。HeLa细胞系的永生标志着现代细胞培养的开始。二十世纪下半叶，许多连续细胞系和其他常用于培养细胞的技术得到了发展，例如胰蛋白酶消化去除附着的细胞，用新鲜培养基将细胞从废培养瓶传代到另一个培养基，在生物反应器中培养细胞，冷冻保存，然后从低温保存中复活细胞。

2. 细胞培养基的建立

哺乳动物细胞培养的第二个基本要素是细胞生长培养基。与创建永生细胞系相一致，同样重要的目标是开发细胞生长的培养基。生长培养基自20世纪80年代首次从盐混合物中开发出来以来已经走过了漫长的道路。在早期，来自动物组织或血液的血清将用于提供必要的营养。1955年，Eagle发明了一种名为basal medium Eagle（BME）的化学配方，使用氨基酸，维生素，矿物质和生长因子。后来根据细胞要求对其进行了修改，在1959年创建了“最低必需培养基”（MEM）和“Dulbecco改良MEM”（DMEM）。尽管DMEM的氨基酸和维生素浓度几乎是BME的四倍，仍然需要补充动物血清以维持存活和细胞增殖。后来，研究人员避免在细胞培养中使用血清，因为单克隆抗体生产中的监管限制，以及无血清培养基制剂的创建。现在有许多配方可用于不同的细胞系和不同的生长水平，包括CD CHO（Gibco），ExCell CD CHO（SAFC），PowerCHO（Lonza）和ActiPRO（GE Life Sciences）等等。

3. 利用哺乳动物细胞生产单克隆抗体

使用细胞培养物进行商业上重要的生物制剂生产始于脊髓灰质炎疫苗的生产。永生和的哺乳动物细胞培养物现在用于生产对人类重要的各种生物分子。这些抗体产物在有限数量的细胞系中产生，包括CHO，NS0和SP2/0.一些其他哺乳动物宿主，包括BHK和HEK用于除mAb之外的有限数量的异源蛋白。目前全球市场上有大量单克隆抗体正在治疗不同的疾病，包括癌症和自身免疫性疾病，还有数十种处于临床试验阶段，预计获得批准。表1提供了目前全球市场上这些不同mAb的快照，以及用于生产它们的细胞宿主。事实证明，二十年来，两种细胞宿主在治疗性抗体的生产中具有极其重要的意义：CHO和NS0。从那时起，这两个候选人已经在各种生长条件和工程方面进行了研究和理解。

3.1 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系

Theodore Puck于1957年从中国仓鼠的卵巢组织中分离出原始的CHO细胞。观察到这些分离的中国仓鼠卵巢细胞本质上是永生的，并且在原代细胞培养物之外向CHO细胞系CHO ori发展。随后用CHO-ori细胞系克隆在1968年产生CHO-K1细胞系。这两种细胞系均在粘附培养条件下生长，并且在大规模过程中的效用受到限制。1971年，汤普森（多伦多大学）采用另一个亚系（现称为CHO-S）在悬浮培养中生长。使CHO细胞适应悬浮环境使研究人员能够使用这种细胞系在更大规模（在生物反应器中）生长。选择标记物表达治疗性蛋白质的必要性导致了20世纪80年代甲氨蝶呤诱导的基因扩增。用甲磺酸乙酯（EMS）诱变CHO-K1细胞系以产生缺乏二氢叶酸还原酶（DHFR）活性的细胞系（通过一个基因座中的敲除和另一个基因座中的错义突变），称为CHO-DXB11或CHO-DUKX。但是，这些细胞可以恢复DHFR活性。在用γ射线诱变时，DHFR基因座的两个等位基因被完全消除，细胞系被称为CHO-DG44。谷氨酰胺合成酶表达系统(CHO-GS）开发的时代始于1989年的CHO-K1SV（加上带有GS基因的载体）。GS和甲氨蝶呤的组合允许选择宿主细胞中不存在的基因并提供作为生物制药生产的一部分遗传掺入外源基因的方法平台。

如今，CHO-DG44和CHO-GS是生物制药行业用于治疗药物生产的两种最普遍的抗体表达系统，因为它们具有扩增外源基因的能力。

3.2 小鼠骨髓瘤细胞NS0

NS0细胞系，也称为非免疫球蛋白分泌细胞系，是NS-1小鼠骨髓瘤细胞系的亚克隆。NS0细胞系最初是由20世纪60年代使用矿物油在近交BALB/c雌性小鼠中诱导的肿瘤产生的。Potter和Boyce小组后来观察到其中一个肿瘤中的细胞分泌免疫球蛋白G1（IgG1），后来在1970年，Horibata和Harris从肿瘤中建立了连续的细胞系。经过多个克隆和培养阶段以消除细胞系中IgG1的产生，1981年Galfre和Milstein创建了非分泌细胞系并命名为NS0/1。从那时起，非分泌性宿主细胞系NS0已被用于产生针对不同疾病的mAb。

二、生产工艺

哺乳动物细胞培养过程开发的主要目标是最大限度地提高细胞生产力并提高产品（mAb或其他蛋白质）质量。提高细胞生产力和产品质量的工艺开发策略包括如下三点

1.细胞系开发

目前主要的抗体表达系统有两个：二氢叶酸还原酶（DHFR）表达系统和谷氨酰胺合成酶（GS）表达系统。

2.基础培养基和流加培养基开发

哺乳动物细胞培养基已从含血清培养基逐渐发展为无血清，化学成分确定的培养基。虽然含血清培养基可以有效地用于各种细胞类型，但血清衍生物质的存在，其浓度因批次而异，造成外来物质污染的风险并降低再现性。牛血清和蛋白质组分如牛血清白蛋白已被重组蛋白和最近无血清化学定义的制剂所取代。虽然难以设计，但化学定义的介质允许更多的一致性。包括在哺乳动物细胞培养基中的关键营养素包括葡萄糖，氨基酸，维生素，痕量金属，生长因子和脂质。

大多数哺乳动物细胞系（包括CHO）将在存在外源胆固醇来源的情况下下调从头胆固醇合成，并且在随后在胆固醇缺乏培养基中培养时，快速上调该途径。NS0细胞是胆固醇营养缺陷型，需要外源性胆固醇才能达到最佳生长。然而胆固醇其高成本和低溶解度仍然是细胞培养过程开发的主要问题，并且与一次性生物反应器的液体接触表面相互作用，导致细胞生长缓慢。Burky等开发了一种补料分批平台，使用富集和优化的无蛋白质，无胆固醇和化学成分确定的基础和饲料培养基，成功地使NS0细胞完全适应无胆固醇环境。

文献链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30499081/