摘要：细胞培养基

在工业用生物制药过程中起着至关重要的作用，因为细胞培养基为高密度活细胞的生长和有效治疗性蛋白质的表达提供了必要的营养和适当的环境。细胞培养基除了保证细胞增长和蛋白表达生产率以外，还应考虑其他介质性能方面的问题，例如产品质量和粉末培养基的可制造性。在过去的几十年中，工业细胞培养基已经从包含动物或植物来源成分的制剂演变为化学成分确定的（CD）制剂，以减少引入不确定因子的可能性并减少原材料的变异性。今天我们讨论的重点是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的培养基开发，包括介绍了哺乳动物细胞培养基的简要历史，一般培养基的开发策略和注意事项等等。

CHO培养基的历史

现今，多种哺乳动物宿主细胞系已用于生产治疗性蛋白质，包括CHO，NS0，BHK，HEK-293和PER-C6。但是，由于CHO具有良好的基因组背景特征，并且在悬浮培养中具有相对较快的生长速度和较高的蛋白质表达产量，因此它被用作生物制品行业的主要生产用细胞系。在1950年代，细胞培养的先驱者开发了培养基的基本配方，例如EMEM和DMEM，它们需要补充血清以支持哺乳动物细胞的生长。科学家汉姆于1965年开发了首个无血清CD培养基F-12，以支持CHO的克隆生长。在其他早期研究中，科学家成功地将胰岛素，转铁蛋白，乙醇胺和硒用于替代CD培养基中的血清。在新兴技术的推动下，CHO细胞的CD培养基开发在过去的几十年中取得了长足的进步，在某些情况下重组蛋白表达量超过了10g/L。

培养基设计策略

与现成的选项相比，自定义或高度个性化培养基的关键优势是配方的选择和优化策略，它可以进行有效的过程优化，影响因素的排除，并更好地了解培养基的各个组成部分对产品质量的影响。生物制药公司通常的策略是：相同CHO宿主细胞系的早期临床项目开发的平台式流程化开发策略，以便将项目从研究快速转移到临床试验中，也就是说先使用通用型的培养基快速的进行上游细胞筛选、驯化等工作，作为平台过程的一部分，可以使用多种CHO细胞系从通用培养基中开发的培养基进行评估。在研究的后期，可以在以后的阶段针对单个细胞系进行进一步的培养基优化。典型的CHO基础培养基包含50-100种成分，每种物质的浓度都应在其最佳范围内，因为各种物质的不足和缺失或过量都有可能会损害细胞的生长、生产率或产品的质量。细胞培养基是多成分组合的混合物，例如碳水化合物、氨基酸、维生素、微量金属元素、盐、脂质、多胺、保护剂和缓冲液等等。培养基开发工作通常集中在优化碳水化合物、氨基酸、维生素和微量金属元素的浓度上。葡萄糖是用于糖酵解和氧化磷酸化为CHO细胞提供能量的主要碳水化合物。丙酮酸是通过糖酵解在细胞培养过程中产生的，丙酮酸的积累抑制了细胞的生长。所以，科学家开发了通过限制葡萄糖或补充其他碳水化合物来控制乳酸的策略。氨基酸是细胞和治疗性蛋白质的组成部分，优化其浓度一直是培养基开发研究的主要重点。使用代谢通量分析在连续CHO培养中鉴定出四个限制性氨基酸和四个过量氨基酸，调整这八个氨基酸的浓度后，峰值细胞密度和蛋白的表达量分别提高了55％和27％。在另一个示例中，科学家Carrillo Cocom等人，使用HPLC监测补料分批培养中的氨基酸浓度，并确定其耗尽、稳态和积累的氨基酸浓度，为合理的培养基设计提供信息。某些氨基酸（例如天冬酰胺和丝氨酸）在特定的CHO细胞系中起关键作用，所以需要通过代谢谱分析研究阐明它们的代谢。水溶性B族维生素由于其作为酶辅因子的作用而在细胞培养基中必不可少，尽管在培养基中的含量非常少量。我们已经对维生素A、D和E在细胞培养基中的生理功能进行了评估，由于它们在水中的溶解度低，因此很少使用。微量金属元素是无血清培养基中另一个必不可少的营养素，其最佳浓度通常低于细胞生长所需要的维生素浓度。与维生素类似，微量金属元素可作为各种酶的辅助因子，并显着影响细胞的生长、生产力和产品质量。作为氧化磷酸化酶的辅助因子，通常在培养物中添加铜以使乳酸从生产转移到消耗。铁已显示出可增强单克隆抗体（mAb）的产生，但必须适当螯合以防止其以游离形式（在无血清培养基中转铁蛋白结合或在无蛋白质培养基中柠檬酸盐螯合）的毒性作用。除铜和铁外，锌和硒是必不可少的痕量金属元素，据报导它们分别可增强mAb的产生并降低氧化应激反应。除了上面讨论的传统营养成分外，各种生长因子（包括肽，低分子量蛋白质和激素）已被证明可以提高产品的效价。Long®R3IGF-I是胰岛素生长因子-1（IGF-1）类似物，旨在提高稳定性，并已通过增加活细胞密度提高融合蛋白的表达量。包含半胱氨酸和酪氨酸的二肽或三肽已用于改善mAb表达量、产品质量、细胞密度和代谢状况。我们已知17种激素可调节各种细胞活动，据报道，氢化可的松是一种类固醇激素，以剂量和时间依赖性方式延长细胞活力并提高融合蛋白产量。此外，最近的研究已经确定了具有不同作用机理的其他滴度增强剂，包括嘧啶核苷，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和非蛋白氨基酸。但是，在使用生长因子和滴度增强剂时，可能需要考虑以下几个方面：成本，溶解度，稳定性，材料来源，对产品质量属性的影响及其在产品制造过程中的清除率，这些都会影响产品的质量，所以我们应该予以重视。

实验方法

传统的一次单因素方法仅允许一次更改单个成分的浓度。对于CHO培养基中大量组成成分，此方法就变得非常费力。同样，由于该方法无法研究各个成分之间的相互作用，因此这种实验方法只可能在实验室条件范围内实现局部最优而不是最终的生产全局最优方案。所以，现在我们使用一种称为实验设计（DoE）的统计方法可以同时评估不同组分的浓度和组分之间的相互作用，同时大大减少了实验条件的数量。通常，首先使用筛选设计（例如析因设计，Plackett-Burman设计和确定性筛选设计）来选择具有重大影响或相互作用的培养基组成，例如，使用Plackett-Burman设计在十二种条件下筛选11种成分，生成CD培养基以支持CHO细胞生长。在另一个案例研究中，使用中央复合设计确定了五组组分的最佳浓度，使细胞密度和表达抗体滴度分别提高了35％和50％。多培养基混合也已用于优化培养基配方。这种方法可以同时生成和评估大量培养基配方，预测最佳配方，并确定各个关键成分以供进一步研究。举例来说，通过混合16种CD配方可实现40％的表达量改善，发现有7种成分是增强这总作用的增强剂。

尽管DoE和培养基混合方法对于培养基成分的设计非常有效，但条件总数仍然可能很大，尤其是在探索具有多个范围和重复实验的许多组成成分条件时。因此，需要具有高重复性和高不确定因素的高通量培养系统。摇晃的容器（例如深孔板，锥形管和摇瓶）最容易使用，因为它们易于安装且具有成本效益。随着微小型化生物反应器系统的推出，在具有pH和溶解氧控制的微型生物反应器中优化高通量的培养基是可行的，这已被证明是代替较大型生物反应器的优化方案。

培养基开发是一个反复的过程，需要进行好几轮性能测试，通过培养基成分的分析和配方的优化，每一轮之后都将逐步提高培养基对细胞的适应性。为了优化培养基配方中的现有成分，至关重要的是在培养过程中准确地对它们进行分析。各种分析技术已被用于量化营养物和代谢物，包括高效液相色谱（HPLC），核磁共振（NMR），气相色谱（GC），电感耦合等离子体质谱（ICP-MS），液相色谱或GC耦合质谱分析（LC-MS或GC-MS）。例如，已将NMR和HPLC结合起来测量所有20种氨基酸，然后补充已鉴定的5种耗尽的氨基酸，从而改善了细胞培养性能。

产品质量的考虑

尽管细胞生长和针对抗体的生产力一直是培养基开发研究的重点，但在整个优化过程中应特别注意产品质量，因为它与治疗性蛋白质的功效、效力和安全性密切相关。据报道，培养基成分会影响许多产品质量属性，包括糖基化、电荷变体、抗体聚合或碎片变体和序列变体。在某些案例研究中举例说明了所选培养基成分对这些产品质量属性的影响。铜被广泛报道会增加基本电荷变异并影响mAb聚集和断裂。锰是调节糖基化模式的众所周知的因素，例如高甘露糖种类，半乳糖基化，唾液酸化和糖基化。已发现胱氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺可增加唾液酸化作用，而胱氨酸也可降低酸性电荷变体和低分子量物质。除了对抗体表达有积极作用外，氢化可的松和Long®R3IGF-1还显示可显着增加Fc融合蛋白的唾液酸化水平。非营养成分，例如乙酰化的N-乙酰甘露糖胺和甘油，也表明可以改善蛋白质的唾液酸化作用。在氨基酸错配方面，有效的预防步骤是提供足够的氨基酸，以防止培养物耗尽这些营养物质。

制造培养基注意事项

尽管液体培养基和储备溶液在培养基开发过程中被广泛用于生成和优化配方，但由于粉末介质更稳定且易于存储和运输，因此在制造过程中最好使用粉末介质。在评估用于粉末介质制造的配方时，应根据溶解度，稳定性和成本选择每种成分的正确化学形式。例如，胱氨酸和酪氨酸的溶解度非常低，通常在高pH值的单独饲料中添加到培养物中。化学修饰的氨基酸s-磺基半胱氨酸和磷酸酪氨酸具有明显更高的溶解度，使其可以与单一培养基结合使用，从而大大简化了细胞培养过程。对于粉末研磨设备，由于其易于维护，更高的组成成分均质性和更少的发热量，药丸磨粉机已经在粉末介质制造的球磨机中占据优势。由于CD培养基粉末的复合特性，至关重要的是表征和控制其变化性，以确保在大规模生产中具有一致的性能。培养基粉末的可变性来源包括组分降解，原材料杂质或污染物，研磨和混合过程以及原材料包装采购。已证明化学计量学与荧光，近红外（NIR）和拉曼光谱法相结合可以评估细胞培养基的一致性。

CHO细胞培养基开发的最新进展

连续灌注培养的培养基开发

在过去的十年中，由于灌注技术具有提高生物反应器的使用效率，降低制造成本和提高产品质量的潜力，因此越来越受欢迎。当从分批补料过程切换到灌注过程时，必须开发一种新的培养基来支持高细胞密度和灌注培养的高生产率。在一项案例研究中，利用现有的分批补料培养基开发灌注培养基，通过混合和浓缩基础和进料培养基，去除不必要的成分并富含氨基酸，维生素，和脂质。同样，在另一项研究中，灌注培养基是从补料的基础培养基和具有DoE方法的培养基中获得的，从而实现了高生产率和理想的产品质量。

Omics技术（各种“组学”）

转录组学，蛋白质组学和代谢组学目前正用于改善生物生产过程。补料分批过程中代谢物通量的代谢组学分析可以指导培养基和补充时间表的设计。转录组学分析产生的数据可用于了解代谢途径，优化细胞培养基和喂养方式。Schaub及其同事举例说明了转录组学在靶向培养基优化中的应用。

根据高滴度和低滴度过程的差异基因表达数据，血脂浓度增加了三倍，导致抗体表达增加了20％。通过使用基于LC-MS的代谢组学方法，发现某些核苷酸/核苷和氨基酸衍生物是凋亡诱导剂，可以帮助他们避免培养基设计的陷阱。此外，蛋白质组学和代谢组学已经结合在一起，用于识别与CHO四个代谢系统相关的细胞应激，从而使目标营养补充物的峰值细胞密度增加了75％。

总结与未来展望

我们概述了CHO细胞培养基的发展，涵盖了营养和产品质量要求，培养基设计要素和实验方法以及培养基制造方面的考虑。尽管将继续使用经验方法，但是计算机建模可有助于加速将来的培养基的开发。作为两种广泛使用的方法，化学计量模型和动力学模型可以潜在地用于确定所有关键介质成分并进行计算机优化，从而大大减少了实验工作量和资源。结合新兴的组学，高通量和分析技术，计算机建模具有巨大的潜力，以令人难以置信的效率和不确定性实现最佳的培养基性能和所需的产品质量属性。

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