得益于细胞生物学中现代组学等新技术带来的对细胞代谢日益深入的了解，和不断涌现的过程监测和分析新技术方法，动物细胞无血清培养基设计在近年来取得了重大进展。细胞培养基供应商不断推出可用于各种生物制剂平台的无血清培养基，但是由于不同动物、组织来源甚至不同亚型的细胞代谢及营养需求都存在巨大差异。

迄今为止，无血清培养基还无法达到经典配方培养基的相对通用性。例如针对 VERO 细胞开发的无血清培养基可能无法成功用于 CHO 细胞的无血清培养。

在众多生物制剂生产平台中，用于治疗性重组蛋白和抗体生产的 CHO 细胞培养平台的无血清培养基发展最为成熟，经历了含血清提取物的无血清培养基、无蛋白培养基、无动物源成分培养基，以及迄今最高级别的化学成分限定培养基等几个阶段。市场上有众多品牌、种类的商品化细胞培养基、补料及添加剂可供研究机构、CRO/CMO 及制药企业等用户选择，用于建立其重组蛋白和抗体等的无血清细胞培养和生产工艺。

01生物工艺开发中细胞培养基的选择

选择合适的细胞培养基用于建立上游工艺是生物制剂开发中的重要步骤，作为制药企业等终端培养基用户，可以选择针对自身工艺平台开发定制化培养基，也可以选择现成的商品化培养基。

目前欧美等国家有成熟生物工艺平台的生物制药企业和 CRO/CMO 公司，大都有自己的生产工艺平台及平台化培养基。即使这样，针对一个新建细胞克隆建立细胞培养工艺时，测试多种培养基（不同品牌或类别）也是非常常见的。因为不同细胞克隆的细胞代谢及其对营养的需求各不相同，平台化培养基不可能在所有项目中都获得可以满足生产要求的结果。

如前述，目前培养基供应商针对不同的细胞培养模式和生产平台，可提供多种商品化培养基供生物工艺开发使用。市场上无血清培养基品牌和种类众多，尤其目前应用最为广泛的治疗性抗体生产的 CHO 细胞培养基。如果确定使用商品化培养基建立工艺，从众多选择中筛选到合适的细胞培养基是生物工艺建立的基础。生物工艺中培养基的选择，要兼顾培养基性能、监管合规、供应安全等多层面要求。

1.1初步确定侯选培养基来源及范围

首先要对培养基组分的可接受性、监管分类及其应用数据等基本特征进行调研。

对供应商的现场审核和验证，培养基产品质量，批次稳定性和再现性，价格和客户服务等多种因素决定培养基供应商是否可被接受。选择经过多年市场验证的，知名品牌培养基供应商的商品化培养基，用于初步筛选可以省去此部分调查的人力、资金及时间的投入。更重要的是，可以减少或避免药物申报中的监管风险及保证药物上市后的培养基的供应安全。

1.2小规模培养基性能和表现评估

确定了候选培养基之后是对不同品牌、种类的候选培养基进行培养和产物表达支持等性能的评估和对比，对于拟建立流加批次培养工艺的培养基筛选，同时进行基础培养基和补料的筛选更为合理。

细胞在生长阶段和表达阶段对于营养成分的种类、比例的需求具有很大差别，基础培养基通常先要保证细胞接种后能够顺利生长，而有些更利于细胞产物表达的成分可能会对细胞生长具有抑制作用，基础培养基和补料的有机搭配，才能获得最佳细胞生长和表达效果。因此，先筛选出基础培养基，再进行搭配补料的筛选，往往会漏掉非常具有潜力的基础培养基。

用于建立培养工艺的细胞株通常是培养并冻存于某种特定培养基中的，细胞可能会对该培养基中的某些特定成分，或者该培养基的营养成分配比产生依赖，更换至另外的培养基中细胞可能会因为不适应而不能给出客观真实的结果。

因此将工程细胞克隆适应至候选培养基中是进行培养基筛选的第一步，也是非常重要的一步。细胞适应后是在小规模对这些培养基的培养表现进行评估。考察因素应包括细胞的最小成功接种密度、细胞增殖率、峰细胞密度、峰活密度持续时间，产物分泌动力学，总产量、单位产量，产品质量、产物稳定性，纯化应用性能和理化性能（例如剪切损伤、泡沫、沉淀，酸碱度控制，代谢废物积累等）。

1.3生产适应性评估

采用摇瓶、小体积生物反应器等小规模评估获得的培养基性能测试结果，需要进一步验证，以确保被选择用于建立生物工艺的培养基在生产规模仍有同样良好的表现。

验证工作可以在能够代表最终生产体系的 Scale-down 模型上，测试和验证培养基的性能表现、多批次培养基的性能一致性等，必要时还需要测试培养基在生产规模上的性能表现，才能够最终确定培养基。

上述情况为理想的生物工艺建立中的培养基选择。有些情况下，由于时间或技术原因，项目申报阶段所选择的培养基和建立的培养工艺，不符合生产工艺的要求，所以很多工艺包括培养基都会在临床试验阶段甚至上市后进行变更。

02培养基的开发和优化

大多数制药企业可以根据成本、生产效率和其他性能特征自由选择培养基和补料。如前所述，已建立了成熟的生物工艺平台的制药企业，用于建立生物工艺的工程细胞株往往来源于相同的宿主细胞和稳定细胞系构建平台，这种情况下很多制药企业会针对其细胞系和工艺平台开发定制化平台培养基，建立平台化工艺，以提高生产效率，简化培养基筛选和工艺开发流程。

培养基开发及优化需要专业的仪器设备，需要具有丰富的专业知识及相关经验的专业人员，同时培养基开发和优化也是非常耗时的，项目难度不同所需时间也大不相同。

有些制药企业会选择与培养基行业中具有影响力的培养基供应商合作，针对特定项目或平台进行定制培养基的开发，这样就可以利用培养基供应商成熟的培养基开发力量，进行针对性的培养基优化和开发。有些时候，随着对工艺开发不断深入的理解，更详细的产品分子定义，监管要求或产品质量要求的变化等，也需要对已有培养基进行组分调整和优化。出于不同目的培养基开发需要选择不同的优化和开发策略。

培养基优化所需的营养素和因子因产品和工艺的不同而差异巨大。例如，某些可以促进细胞生长的因素对于蛋白质表达或病毒产生具有负面影响。区别和平衡各种优化目标，诸如获得最大化细胞密度，提高重组产物表达效率，改善产品质量，降低病毒污染等目标，对于制定合理的培养基开发和优化策略非常重要。

2.1培养基与生物制剂的产品质量

随着对生物药物理解的不断深入和要求的不断提高，工艺开发人员不仅必须考虑细胞培养基的培养性能、稳定性和成本，还必须考虑到培养基对一系列产品质量特征的影响。

蛋白质的糖基化等翻译后加工修饰，可影响许多重组蛋白类药物的关键质量属性，包括产品的稳定性、溶解性、聚集、血清半衰期 、免疫原性、抗蛋白酶水解、药代动力学、抗体依赖性细胞毒性，以及药效学和临床表现等。

工艺参数，培养基和补料代谢物、辅助因子和生长因子等都会影响细胞的翻译后加工效率和准确性。

培养基的组成既可以影响细胞培养的生长效率和细胞密度，也会影响糖基化等翻译后加工修饰所需糖基转移酶等关键酶的功能水平，及内质网和高尔基体的转运和持续时间，或直接影响细胞间核苷酸糖/糖基供体转运，进而对蛋白的糖型等质量特征产生影响。

此外，培养基的选择对下游纯化工艺的影响也越来越受到关注，知名品牌商品化培养基组分构成都兼顾了纯化工艺的要求。

图 3 Hyclone 通过定制化培养基，产品产量及质量获得显著提高和改善

2.2培养上清分析

开发和优化培养基的一个主要工具是培养基消耗分析，即通过检测培养基各种成分随时间的变化梯度，来了解细胞在整个培养过程中需要或者正在使用哪些组分。这有助于对基础培养基和补料成分进行合理的微调，提高细胞活力、培养峰密度和延长培养周期，以获得最佳产物产量和产品质量。

细胞培养消耗分析已被用于工艺开发、中试，甚至在 GMP 生产中，例如，在生产中可用于快速工艺故障排除。

分析项目通常包括主要代谢物、次要代谢物（尤其是那些被确定为有毒的代谢物）、微量元素或金属离子、生长、附着和转运因子，特殊结构元素（如胆固醇）、理化指标（如 pH 和渗透压）、表面活性剂，以及所需生物产品的含量和质量。比如：葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸盐、钠离子、钾离子、钙离子、酸碱度、PCO2、PO2 和氨，氨基酸，水溶性维生素：吡哆醇、烟酰胺、叶酸、B12、核黄素和硫胺，以及类脂和微量元素或金属。

2.3培养基开发和优化中的实验设计（DOE）

实验设计（DOE）是一种计划实验和分析所获得信息的数理统计方法，主要对实验进行合理安排，以较小的实验规模 (试验次数)、较短的实验周期和较低的实验成本，获得理想的试验结果并得出科学的结论。

该技术通过使用最少数量的实验，其中几个实验参数系统地同时变化，以获得足够的信息。根据获得的数据，建立了所研究过程的数学模型（例如：补料的数量和时间）。该模型可用于了解实验参数对实验结果的影响，建立最佳工艺。

定制设计的软件可用于创建实验设计、获取模型和可视化生成的信息。DOE 方法可以大大提高筛选合适实验条件的效率，例如细胞培养、营养补充、因子水平、工艺优化或稳健性测试。

图 4 细胞培养基开发的基本方法

03欧美生物工艺中细胞培养基使用现状

随着国产 PD-1 单抗正式获批上市，和更多抗体项目进入临床放大和生产阶段，中国生物制药行业进入战略发展期。临床放大及生产阶段和前期开发和申报阶段对包括细胞培养基在内的原料的考量重点往往相差甚远。了解成熟的欧美生物制药企业生物工艺中细胞培养基选择，可能对于开始走向成熟的中国生物制药行业具有启迪作用。

3.1培养基的个性化开发和优化

在今天的欧美，用于生物制剂生产的大多数细胞培养基都是针对特定的细胞系、工艺平台和应用进行了个性化开发和优化的。

细胞培养基的开发优化，及之后的生产和运输是一项系统化的工程，涉及以细胞代谢知识为基础的培养基配方开发，配方可生产性验证，成品的稳定性分析，培养基的大规模生产，严格系统的质量管理体系，及完备的风险控制策略等。

成熟的培养基供应商经过多年的积累和努力，拥有完善的培养基开发和生产及质量管理体系。因此制药企业通常会选则由培养基供应商进行细胞培养基的定制化开发和生产。

也有些制药企业会自行或与科研机构合作开发甚至生产培养基，但是他们往往仅具备上述培养基开发和安全供应体系等链条中的某部分功能，比如培养基配方的开发和小规模细胞培养测试。然而，要想精确有效的开发出好的培养基配方，验证其可生产性，证明所开发配方在储存中的稳定性，可应用性，保证其生产的合规性，供应的连续性等，则需要上述的系统化运行才可能达到。这一点经过多年市场验证的商业化培养基公司更有可能做到。

有些大学、研究机构或制药企业的实验室可以进行一些原始培养基配方的开发，也擅长细胞培养。但是，极少有实验室具备可以模拟培养基大规模生产的 Scale-down 模型，以及应用其进行培养基配方可生产性评估的经验。培养基配方通常在小规模高通量形式下开发出来的，但一个最终可以被大规模生产的培养基配方，必须在能够反映生产规模的条件下进行验证。这些实验室需要但缺乏的另一个功能是，如何获得符合生产规模和监管要求的培养基原料，并且可以用于 cGMP 生产。

无论哪种方式，培养基供应商和制药企业都将这些配方视为机密的专有知识产权，因为定制化培养基的开发需要相当大的成本和时间以及多年的经验积淀。

3.2选择干粉还是液体培养基

对于在生物生产的大规模细胞中所使用的细胞培养基，目前欧美很多制药企业选择与培养基供应商合作，由培养基生产商将配制好的完全液体培养基装在一次性储液袋中，运送至培养基使用场地；也有些药企选择自行将培养基干粉配制成液体。

两种选择各有优缺点！

液体产品的保质期通常在 6 个月~2 年的范围内。而大多数粉末培养基经过验证，可以有 3 年或更长的保质期。粉末培养基本身及其运输成本较低，并且在水合时可以进一步按照需要添加组分。

而拥有自主产权培养基配方的药企，更倾向于选择只将部分配方交给培养基供应商生产成培养基干粉，在配制成液体过程中再自行添加组分制成完全培养基。就培养基本身而言，液体培养基的价格和运输成本会明显高于培养基干粉，但是由培养基供应商直接提供液体培养基的优点也显而易见，对于大型生产操作尤其如此。随着优质的大体积一次性包装袋的出现，作为终端用户的药企可以将培养基供应商提供的完全液体培养基直接投入生产，而无需进一步在配方中添加成分，从而消除了任何额外的操作或质量控制测试。

配制液体培养基需要：①可获得的大量优质水；②专业人员，正规的水化，过滤灭菌和质控检测程序；以及③在注射用水（WFI）系统溶解粉末所需的资本支出，包括混匀、储存及过滤设备和处理设备（以及它们的清洁验证）。

设计和建造用于制造大量 WFI 优质水系统；专门配液空间的设计建造，验证，测试以及这些系统的维护所需要的时间和成本以及风险等等，是选择自行配制培养基液体的药企必须要考虑的。

相反，如果直接使用培养基供应商提供的液体培养基则不需要这些成本和基础设施的建造，药企可以借助培养基供应商的设施，专业知识、经验，加工认证，以及培养基水化和消毒相关的质量控制和风险控制体系，非常适合那些希望简化运营以降低成本的药企。

因此，表面上粉末培养基的成本似乎低于液体，但是粉末水合时所需的额外成分补充及相关验证，设备设施，劳动力和测试等所产生的费用，都使得使用完全液体与粉末培养基的成本差异不那么明显。

良好的批间一致性是培养基必备的基本属性，在使用液体培养基和干粉培养基的批次间一致性方面，目前看法还存在分歧：目前液体产品的最大批量通常为 10,000L，而粉末培养基的批次产量可达到 600,000L 以上。

一些人认为粉末培养基生产的较大批量提供了更大的批次一致性；而直接使用由培养基供应商提供的液体培养基的支持者则认为，由经过验证的优质供应商提供的液体培养基，可以减少液体配制过程中产生的差异，更能够保证批次一致性。

END 结语 Conclusion

正如瑞士联邦科技学会生物工艺学教授 Wurm 博士所说，「培养基虽不是细胞培养中唯一重要因素，但确实是最重要的一种」。

细胞培养基是以动物细胞大规模培养为技术平台，研发及生产生物药品的关键原材料之一。生物工艺中细胞培养基的选择要兼顾培养基使用性能、监管合规、供应安全、下游纯化工艺易行性、及经济成本等多层面要求。

原文链接：https://zhuanlan.zhihu.com/p/81963676