qPCR的出现得益于DNA聚合酶5’核酸外切酶活性的发现[1]和荧光检测设备（CCD）的问世。核酸外切酶活性可以将链延伸的过程中碰到的杂交探针给水解掉，从将荧光分子释放下来发出荧光信号。探针是参与qPCR反应的重要元件[2]，它是一条能与扩增区段杂交的寡核苷酸单链（Fig.1）。其5’端标记了特定的荧光基团Reporter，比如常见的FAM，用于指示荧光信号；3’端标记了特定的荧光淬灭基团Quencher，比如TAMRA，它可以吸收荧光基团发出的光，使其淬灭，这就是荧光共振能量转移（FRET）。因此一条完整的探针理论上是不会发出荧光的，因为荧光基团发出的光都被淬灭基团所吸收，但当探针被水解掉之后，其结构不再完整，淬灭基团就不能吸收荧光了。                           

Figure 1. 探针法荧光定量的原理示意图

      理论上，每扩增一个循环，N个靶标分子产生出2N个新分子，同时会产生N个新的reporter，因此荧光信号就与产物的量成正比。在循环开始之前和结束之后都分别测定reporter和quencher的荧光强度（在整个PCR过程中quencher的荧光强度基本保持一致），RQ+为循环结束后的reporter强度除以quencher的强度，RQ–为循环开始前的reporter强度除以quencher的强度，该循环的荧光强度△RQ=RQ+-RQ–。在反应的初期，参与反应的“原材料”是充足的，PCR是指数扩增，△RQ也是呈指数增加的，但是初始的荧光分子数目太少，荧光需要累积到一定的循环数后才能被CCD检测到，这段时期叫做背景期（Baseline，Fig. 2）。背景期后为指数扩增期，在该时期PCR反应一直维持指数扩增，直到原材料接近耗尽后，才开始逐渐进入平台期，荧光信号不再变强。对于qPCR来讲，指数扩增期才有意义。

Figure 2. qPCR中典型的扩增曲线[3]

      如何定义指数期？根据背景期荧光信号的变异程度可以设定一个统一的threshold，即前15个循环（一说是10个循环）的荧光信号的mean值加10倍的SD[3]，到达threshold需要的循环数即为Cq值（国际标准委员会统一使用Cq代替CT）。Cq值显然与初始的靶标的量存在负相关，即初始的量越多，Cq值越小。下面简单的推导过程有助于理解如何使用标准曲线来实现定量。

Figure 3. qPCR定量靶标的原理

       由上述的推导过程可以看出，靶标初始量N0的对数与Cq呈线性反比关系。通过梯度稀释已知浓度的标准品，即可绘制标准曲线用于定量未知样品（Fig 4）。

Figure 4. 用于定量未知样品中β-actin的标准曲线

       下一期我们将讨论Cq的决定方式及意义，加深对qPCR原理的理解。

参考文献

1.     Holland,Pamela M., et al. “Detection of specific polymerase chain reaction productby utilizing the 5′—-3’exonuclease activity of Thermus aquaticus DNApolymerase.” Proceedings of the National Academy of Sciences 88.16 (1991):7276-7280.

2.    Lee,Linda G., Charles R. Connell, and Will Bloch. “Allelic discrimination bynick-translation PCR with fluorgenic probes.” Nucleic acids research 21.16(1993): 3761-3766.

3.    Heid,Christian A., et al. “Real time quantitative PCR.” Genome research6.10 (1996): 986-994.