qPCR中一般选择前面的3-15个循环的荧光值作为背景值，取其mean+ 10*SD作为阈值线（Fig 1），这叫做Threshold Method。目前市面上几乎所有主流机器都采用这个策略作为默认的决定方式。我们讲过阈值线要设立在指数扩增期，但在背景期时PCR反应仍然是指数扩增。目前检测荧光信号的CCD设备，其检测灵敏度差不多在10^10个荧光分子，即PCR反应产生出这个数量的荧光分子后才可以被CCD检测出信号[1]。PCR反应初期，荧光信号太弱，而且易受到CCD噪音的干扰，因此阈值线是一定要设立在背景之上的；那是不是只要高过背景且在指数扩增期就可以了？当然不是，考虑到极低拷贝数的样本，如果阈值线设得过高，则不会得到Cq值，因为扩增曲线刚刚扬起反应就结束了。因此总的原则是，阈值线要显著高于背景信号且尽可能的接近背景信号，由此才有这一条设立规则。

Figure1. 标准的扩增曲线

       尽管大家公认这一原则，但并不意味着它是唯一正确的。事实上，阈值线的设立是比较主观的。可能存在这种情况：按照这一原则设立阈值线而得到的标准曲线其线性相关系数R2不尽如人意，而将阈值线向上移动后，反而R2值更接近于1。原因可能有以下几种情况：荧光干扰、反应体系中存在气泡或者机器噪音的增加，这都会导致背景漂移（忽上忽下），即变异系数的假性增加[2]（Fig 2）。

Figure2. 背景漂升的非典型扩增曲线

      为解决这个问题，可以采用第二种决定方式：Fit-pointMethod。与采用baseline信号的Threshold Method不同，在log-scale视图模式下，Fit-point Method摒弃所有的背景信号点（noise band），阈值线就设立在noiseband之上并在指数扩增期即可[3]。这时肉眼是很容易判断指数扩增期的，即log-linear区域。一般情况下，不同的阈值线导致的结果差异并不大，都是可接受范围之内的（Fig3）。

Figure3. Fit-pointMethod中阈值线不同位置对结果的影响不显著[4]

       Threshold Method和Fit-point Method都是依赖于对指数扩增期的主观判断，且都是基于一个前提假设：相同的荧光信号对应相同的核酸数量。另外的一种尝试则从单个扩增曲线入手，仅从其构型特点出发即可得到扩增效率等信息，即2ndDerivative Maximum Method。在指数扩增期时荧光信号倍增速度是最快的，也就是扩增曲线的切线斜率是最大的，这个点是与DNA浓度相关的且是唯一的[3](Fig 4)。理想情况下，不同浓度的同一target其扩增曲线的拐点是一致的，但即使有差异，最终得到的标准曲线也是合理的。该方法在在一个批次实验中某几个样品扩增出现特殊情况（扩增构型与其它大多数样本不那么一致）时应用是更合适的。

Figure4. 2ndDerivative Maximum Method对于单个样本的判断更为准确合理

       综上所述，ThresholdMethod是最通用的Cq决定方式，但当baseline信号出现不稳定的时候，Fit-point Method可以将这种不稳定因素对于阈值线判断的影响降到最低。当没有标准曲线，但又要判断两个扩增曲线构型不同的样本的浓度倍比关系时，2ndDerivative Maximum Method是最合适的方法。