细胞培养方法(一):细胞培养基本知识

背着弓箭的小黑 2021-07-22 09:44:56 阅读: 1591

选择合适的细胞系• 种属非人类和非灵长类动物细胞系通常生物安全性限制较少，但是需要根据要开展的实验来最终决定是否要使用种属特异性培养物。• 功能特性

实验的目的是什么？例如肝脏和肾脏来源的细胞系可能更适合做毒性测试，大脑、脊髓组织来源的细胞多用于神经系统相关研究。

• 有限细胞系还是连续细胞系

虽然选择有限细胞系会使您在表达正常功能时有更多的选择，但是连续细胞系往往更容易扩增和维持。

• 正常还是转化细胞

转化细胞系通常生长速度较快，接种效率较高，且可连续培养，培养基中需要的血清较少，但是由于遗传转化，其表型已经发生了永久性变化。

• 生长条件和特性

对细胞生长速度、饱和密度、克隆形成率以及悬浮生长能力有何要求？例如：要大量表达重组蛋白，可能应选择生长迅速且能悬浮生长的细胞系。

• 其他标准

如果使用的是有限细胞系，细胞储备充足吗？细胞系的性质明确吗？需要自己进行验证吗？如果使用的是正常细胞系，有等效的正常细胞系可以作为对照吗？细胞系稳定吗？如果不稳定，那么这种细胞容易扩增以便为实验提供充足的冻存储备吗？

获取细胞系

可以通过原代细胞建立自己的培养系，或者也可选择从商业供应商或者非盈利性供应单位 (即细胞库) 处购买已经建立的细胞系。声誉良好的供应单位可提供优质的细胞系，而且会认真地对细胞系进行检测，以确保其完好性，并且未被污染。我们不建议从其他实验室借用细胞，因为这会带来很高的污染风险。无论来源如何，使用细胞之前都应确保所有新到细胞系已经过支原体污染检测。

培养环境

细胞培养的一大优势在于能够控制细胞生长的物理化学环境(即：温度、pH 值、渗透压、O2 和 CO2 浓度)和生理环境(即：激素和营养素浓度)。除温度外，培养环境均由生长培养基控制。

虽然细胞培养的生理环境不如其物理化学环境明确，但是通过对血清成分更好地了解、确定细胞增殖所需的生长因子以及更好地了解培养过程中的细胞微环境 (即：细胞间相互作用、气体扩散、细胞-基质相互作用)，现在可以采用无血清培养基进行一些细胞系的培养。

贴壁培养与悬浮培养

目前主要有两种基本的细胞培养体系，一种是使细胞在人工基质上单层生长 (贴壁培养)，另一种是使细胞在培养基中自由漂浮生长 (悬浮培养)。除造血细胞系和其他一些细胞外，大多数脊椎动物细胞均具有贴壁依赖性，必须在合适的基质上培养，且该基质必须经过特殊处理，以便细胞粘附和伸展组织培养处理。但是，许多细胞系也可采用悬浮培养，悬浮培养细胞可在未经组织培养处理的培养瓶中培养，但是培养容量表面积比(通常为0.2–0.5 ml/cm2)的增加，阻碍了有效的气体交换，因此需要对培养基进行搅动。这种搅动一般通过磁力搅拌器或者转瓶实现。

注：除了贴壁细胞和悬浮细胞之外，还有一种半悬浮/半贴壁的细胞。pH 值大多数正常的哺乳动物细胞系都能在pH =7.4的环境中生长良好，而且不同细胞株间差异极小。但是，目前发现有些转化细胞系在轻度偏酸性的环境(pH 7.0-7.4) 中生长较好，而有些正常的成纤维细胞系更适合轻度偏碱性的环境(pH 7.4-7.7)。二氧化碳生长培养基可控制培养体系的pH值，为培养的细胞缓冲pH值的变化。这种缓冲作用通常是通过添加有机缓冲盐(例如：HEPES)或者二氧化碳-碳酸氢盐缓冲盐实现。由于培养基的pH值取决于溶解态二氧化碳(CO2)与碳酸氢盐(HCO–)间的精密平衡，因此空气中二氧化碳含量的变化会改变培养基的pH值。为此，使用二氧化碳-碳酸氢盐缓冲盐培养基时必须使用外源性二氧化碳，特别是使用开放式培养皿培养细胞或者进行高浓度的转化细胞系培养时。虽然大多数研究人员通常使用浓度5–7%的二氧化碳，但是4–10%浓度的二氧化碳适用于大多数细胞培养实验。然而，每种细胞的培养条件不一，每种培养基均具有其推荐的二氧化碳压力和碳酸氢盐浓度，以便达到正确的pH值和渗透压；更多信息请参阅培养基制造商提供的说明书。

温度

细胞培养的最佳温度主要取决于细胞供体的体温，此外也受到解剖部位体温差异的影响( 例如：皮肤温度低于骨骼肌的温度)。与温度过低相比，细胞培养时温度过高是更为严重的问题；因此，往往将培养箱的温度设定为略低于最佳温度。大多数人和哺乳动物细胞系在36℃至37℃下具有最佳生长状态。

细胞污染

定期检查培养细胞的形态(即：形状和外观)对于细胞培养实验取得成功至关重要。除确认细胞健康状态外，每次操作细胞时通过肉眼和显微镜检查细胞还可早期发现污染征象，避免污染扩散至实验室其他细胞。

细胞变质的征象包括核周出现颗粒、细胞与基质解离以及细胞质空泡形成。这些变质征象可能为多种原因所致，例如：培养物污染、细胞系衰老或培养基中存在毒性物质，或者这些征象仅表明培养物需要更换培养基。变质严重时将会成为不可逆的变化。

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