细胞培养方法(二):传代培养

背着弓箭的小黑 2021-07-22 09:47:52 阅读: 1986

传代培养

传代：去除原培养基并将细胞从原培养体系转系到新鲜的生长培养基中，该过程可使细胞系或细胞株进一步增殖。

接种后培养细胞的生长将从延滞期进入对数期，细胞呈指数增殖。当贴壁培养的细胞已占据所有可用基质、没有扩增空间，或者悬浮培养的细胞已超过培养基所能支撑的能力，无法进一步生长时，细胞增殖速度将大大降低甚至完全停止。为了将细胞密度维持在最佳水平，以便细胞继续生长，并且刺激其进一步增殖，必须将培养物分成若干部分，并添加新鲜培养基。

如上为培养细胞的典型生长模式图

如上半对数图显示了细胞密度与培养时间之间的关系。培养中的细胞通常按照标准生长模式增殖。细胞接种后第一个生长阶段是延滞期，此阶段细胞生长缓慢，处于适应培养环境、为快速生长做准备的状态。延滞期之后是对数期，此阶段细胞呈指数增殖，消耗生长培养基中的营养素。当所有生长培养基均被耗尽 (一种或多种营养素耗竭) 或者细胞已占据所有可用基质时，细胞即进入静止期，也称平台期，其增殖速度大大降低甚至完全停止。

何时传代？

贴壁培养细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代。正常细胞达到汇合状态时会停止生长 (接触抑制)，重新接种后需要较长时间才能恢复。转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖，但是在经过大约两个倍增时间后通常会变质。悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。

如上三图分别为HEK293T细胞培养过程中的不同密度情况：由上至下：图1为培养2天后，细胞密度约为40%，此时细胞密度偏低，不宜进行传代；图2为培养3天后，细胞密度约为80%，此时可进行细胞传代；图3为培养4天后，细胞已经几乎长满，此时的细胞密度约为97%~100%，这时再进行传代就太晚了。

乳酸是细胞代谢的副产物，生长培养基 pH值降低通常表示乳酸蓄积。乳酸有细胞毒性，而且pH值降低也是细胞生长的不利因素。pH值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度，细胞浓度越高，培养基耗竭的速度越快。如果发现 pH值迅速降低(> 0.1–0.2 pH 单位)，同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。

严格按照预定时间进行细胞传代可确保细胞的生物学行为稳定，便于监测其健康状态。从某一接种密度开始逐渐调整细胞接种密度，直到达到适合该细胞的稳定生长速度和产量。细胞偏离确定的生长模式通常表示细胞健康状况不佳(例如：变质、污染)或者培养体系的某一组分功能异常(例如：未达到最佳温度，培养基过于陈旧)。

建议保留详细的细胞培养记录，记录处理及传代时间、所用培养基种类、解离方法、分种率、形态学观察结果、接种浓度、产量和抗生素用法。最好按照传代时间安排开展实验和其他非常规操作(如更换培养基种类)。如果您的实验安排与常规传代时间安排不吻合，则应确保当细胞仍处于延滞期或者已经达到汇合状态、停止生长时，不进行传代。

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