PCR产物2900bp，TA克隆总是连不上怎么回事？

智能科研狗 2016-09-09 15:28:04 阅读: 2210

石俊超吓葰：各位大神，我的pcr产物2900bp，要连接到PMD18-T载体测序，为什么总是连接不上去呢？

金成一：你primer后面设计用是什么酶？

石俊超吓葰：高保真酶

金成一：哈哈，我指的是ECORIO， NotI 这些酶。你用的那两个酶切位点？

石俊超吓葰：没有酶切，加A后，TA连接。

金成一：TA链接那种啊？这几天研究室刚好有人做，我看他们做得挺顺利的，用的是TA链接专用的kit！不过我没亲自做过，不太清楚咋回事不好意思帮不上忙

石俊超吓葰：没事，非常感谢。我想会不会是片段太长。我们实验室做1000左右的也都很好

金成一：不过他们也是完全按照说明书上去做的，估计会不会是fragment dna和vector的比例问题，因为你的将近3kbp，是1kbp近3倍，感觉可以试试加大fragment dna的量试试

石俊超吓葰：嗯，我按照你说的试试看。

金成一：哈哈，好的另外做出来之后和空白对照比较，colony数目没有什么差别的话，有时候其实是有连接成功参在里面的。尤其做出几次的结果都是一样的话，拿十几个colony来增值提取dna，直接load电泳看看dna大小大概就可以知道哪几个插进去了。之前做cDNA library的时候的确出现过大fragment连接进vector的数量比小fragment的少很多。

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